Activation du cerveau antérieur basal

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 22044 (2022) Citer cet article

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Les signaux environnementaux et les états internes tels que l'humeur, la récompense ou l'aversion influencent directement les comportements alimentaires au-delà de la nécessité homéostatique. L'hypothalamus a été largement étudié pour son rôle dans l'alimentation homéostatique. Cependant, de nombreux circuits neuronaux qui pilotent une alimentation plus complexe et non homéostatique qui intègre la valence et les signaux sensoriels (tels que le goût et l'odorat) restent inconnus. Ici, nous décrivons un circuit de prosencéphale basal (BF) à habenula latéral (LHb) qui module directement le comportement d'alimentation non homéostatique. À l'aide de la cartographie des circuits à médiation virale, nous avons identifié une population de neurones glutamatergiques au sein du BF qui se projettent vers le LHb, qui répond à divers signaux sensoriels, y compris les odeurs aversives et liées à la nourriture. L'activation optogénétique des circuits BF à LHb entraîne une aversion robuste et réflexive. De plus, l'activation de ce circuit supprime la volonté de manger à jeun. Ensemble, ces données révèlent un rôle des neurones glutamatergiques du cerveau antérieur basal dans la modulation des comportements d'aversion et d'alimentation associés à la LHb en détectant des signaux environnementaux.

L'alimentation est un comportement appétitif essentiel à la survie de tous les animaux. L'alimentation homéostatique, ou alimentation pour répondre aux besoins caloriques, consiste à équilibrer la production calorique avec l'apport calorique pour maintenir un poids et une santé métabolique appropriés. Cependant, ce n'est qu'un élément du comportement alimentaire. Les signaux environnementaux (tels que le goût et l'odorat), l'humeur, la récompense et l'aversion affectent tous l'alimentation et peuvent entraîner une consommation alimentaire au-delà ou en dessous des besoins caloriques sains normaux1,2,3. Contrairement à l'alimentation homéostatique, ces mécanismes d'alimentation non homéostatiques ont évolué pour rendre les organismes adaptables à un environnement changeant, dans lequel les sources de nourriture peuvent ne pas être fiables. Cependant, lorsque la nourriture est facilement accessible, ces mécanismes peuvent devenir inadaptés.

Un exemple classique d'alimentation non homéostatique est le comportement hédonique basé sur la récompense qui pousse un animal à consommer de la nourriture au-delà de ses besoins caloriques. Réciproquement, des signaux alimentaires aversifs et/ou des stimuli menaçants peuvent empêcher la prise de nourriture même à jeun. Par exemple, les signaux qui indiquent de la nourriture gâtée ou un prédateur à proximité peuvent conduire à un comportement d'évitement ou d'évasion primordial, respectivement, pour assurer la survie. Bien qu'il soit généralement reconnu que l'hypothalamus régule les aspects clés de l'alimentation homéostatique4,5,6,7,8, et que les voies d'homéostasie, de récompense et d'aversion convergent pour régir l'alimentation9,10,11, les circuits, les constituants neuronaux et les modèles de la connectivité fonctionnelle qui médiatise le comportement alimentaire non homéostatique reste largement inconnue.

Nous et d'autres avons récemment identifié le prosencéphale basal comme un nœud de circuit qui a un impact direct sur l'alimentation non homéostatique12,13,14. Notamment, lorsque les neurones excitateurs et glutamatergiques du BF étaient génétiquement ciblés pour une activation chronique, les souris présentaient une hypophagie grave et mortelle. Cette suppression de l'alimentation s'accompagnait d'une aversion pour la nourriture et les stimuli liés à la nourriture. Les projections de BF glutamatergiques vers la zone hypothalamique latérale (LHA) ont été identifiées comme partiellement responsables à la fois de l'hypophagie et de l'aversion observées, cependant, l'activation directe des terminaux glutamatergiques BF dans la LHA n'a pas complètement phénocopé l'aversion associée à la nourriture affichée par l'activation du corps cellulaire BF , suggérant que d'autres cibles en aval du BF contribuent à l'aversion alimentaire observée12.

Grâce à la cartographie de projection antérograde à médiation virale, nous avons constaté que les neurones glutamatergiques du BF se projettent également vers l'habénule latérale (LHb), un centre d'aversion important dans le cerveau3,15, et que le LHb reçoit des informations sensorielles du BF. De plus, lorsque les projections BF vers LHb sont activées, ce circuit entraîne une puissante aversion réflexe qui perturbe la mémoire. Ce circuit supprime le désir homéostatique de manger sans affecter l'appétit. Ensemble, ces données identifient un circuit cérébral qui relie le cerveau antérieur basal glutamatergique au LHb pour moduler directement l'alimentation indépendamment de l'état homéostatique.

Pour déterminer comment les neurones vGlut2BF peuvent entraîner l'arrêt de l'alimentation via des circuits d'évitement/aversion, nous avons d'abord cherché à identifier les cibles effectrices en aval impliquées dans les comportements aversifs. Pour cela, nous avons effectué une cartographie de projection antérograde en injectant stéréotaxiquement un virus adéno-associé Synaptophysin :: mRuby2 dépendant de Cre (rAAV-Ef1α-flex-Synaptophysin :: mRuby2) dans le cerveau antérieur basal de souris vGlut2-Cre+/−, permettant l'identification des terminaux BF présynaptiques et leurs cibles présumées en aval (Fig. 1a, b). Nous avons observé de nombreuses terminaisons dans des régions décrites précédemment avec un apport connu de BF glutamatergique, y compris la zone hypothalamique latérale (LHA), que nous avons étudiée précédemment (Fig. 1c, Supp. Fig. 112). Notamment, l'habénule latérale (LHb) était fortement innervée par les projections BF (Fig. 1d). Étant donné que l'habénule latérale est connue pour entraîner des comportements aversifs, nous avons étudié la connectivité vGlut2BF-à-LHb (vGlut2BF → LHb) en tant que circuit candidat pour médier l'aversion et la suppression de l'alimentation.

Les neurones glutamatergiques BF innervent de manière robuste la LHb et sont fonctionnellement connectés aux neurones glutamatergiques LHb. ( a ) Configuration expérimentale pour le traçage antérograde à partir de cellules vGlut2BF. ( b ) Ciblage viral représentatif de Synaptophysin :: mRuby2 dépendant de Cre vers le prosencéphale basal (BF, Bregma 0, 62). Barre d'échelle = 300 μm. ( c ) Quantification des différentes régions du cerveau recevant l'entrée glutamatergique de BF. Quantification calculée comme la densité de terminaisons Syn :: mRuby2+/volume de la ROI. PC, cortex piriforme ; LHb, habenula latérale ; LHA, zone hypothalamique latérale ; VMH, hypothalamus ventromédian ; DMH, hypothalamus dorsomédian ; VTA, aire tegmentale ventrale ; PAG, gris périaqueducal ; PMN, noyau prémamillaire ; IPR, noyau interpédonculaire. ( d ) Terminaux de projection Synaptophysin :: mRuby2 dans l'habénule latérale (LHb) (Bregma - 1, 82). ii) Encart zoomé. MHb, habenula médiale. ( e ) Configuration expérimentale de l'expérience de cartographie de circuit assistée par channelrhodopsin, stimulant les terminaux vGlut2 + BF tout en enregistrant à partir de cellules mRuby + / vGlut2 + dans le LHb. ( f ) Fibres ChR2-EYFP des neurones vGlut2BF se terminant par la LHb. Les cellules mRuby+ vGlut2LHb dans la LHb se chevauchent avec les projections BF exprimant ChR2. ( g ) Trace électrophysiologique ex vivo représentative de la cellule mRuby + dans la LHb. LCR, liquide céphalo-rachidien (témoin). TTX (1 μM), 4-AP (0,5 μM) et CNQX/AP5 (10 μM/ 50 μM) ajoutés séquentiellement. ( h ) Mesures de courant (pA) de cellules mRuby + LHb après stimulation optogénétique des terminaux BF dans (1) aCSF (− 320,20 ± 71,30 pA), (2) + TTX (− 44,20 ± 19,20 pA), (3) + 4AP ( − 243,10 ± 47,08 pA) et (4) + CNQX/AP5 (− 20,43 ± 4,64 pA). Les barres d'erreur représentent SEM. Comparaison statistique à l'aide d'une ANOVA à un facteur comparant tous les groupes au groupe témoin aCSF. aCSF vs TTX : p = 0,0010, aCSF vs + 4AP : p = 0,5496, aCSF vs + CNQX/AP5 : p = 0,0013. n = 12 pour aCSF, n = 10 pour TTX, n = 11 pour 4AP et n = 7 pour CNQX/AP5. (i) Amplitude moyenne des cellules mRuby + LHb dans l'aCSF et avec l'ajout de TTX et de 4AP. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 12 et 11, respectivement. aCSF = − 320,20 ± 71,30 pA, + TTX/4AP = − 243,10 ± 47,08 pA. Statistiquement comparé à l'aide d'un test t non apparié, p = 0,3859. ( j ) Latence moyenne à 10% du courant maximum des cellules mRuby + LHb lors de la photostimulation des terminaux BF (5, 940 ± 0, 04 ms). Les barres d'erreur représentent SEM. n = 15.

Pour étayer les données de traçage anatomique, nous avons ensuite testé si le cerveau antérieur basal et l'habénule latérale sont fonctionnellement connectés. Étant donné que des études antérieures ont montré que la LHb contient principalement des cellules vGlut2 + 16, nous avons injecté un AAV exprimant la Channelrhodopsine (ChR2) dépendante de Cre dans le BF (rAAV-Ef1α-flex-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE-pA) et un Cre-dépendant Virus rapporteur mRuby2 dans la LHb (rAAV-Ef1α-flex-mRuby2) des animaux vGlut2-Cre+/− (Fig. 1e, f). Ensuite, nous avons sélectivement photostimulé les neurones vGlut2BF qui se projettent vers le LHb, tout en effectuant des enregistrements de cellules entières guidés visuellement à partir de cellules mRuby+ vGlut2+ au sein du LHb. Dans les neurones cibles LHb enregistrés, nous avons observé une dépolarisation robuste avec la photostimulation vGlut2BF avec une amplitude moyenne de - 320, 20 ± 71, 30 pA (Fig. 1g – i). De plus, la latence moyenne entre la fin d'une impulsion lumineuse de 473 nm et un courant maximal de 10 % était de 5,94 ± 0,039 ms, suggérant une connexion monosynaptique (Fig. 1j). De plus, la réalisation d'enregistrements en présence de TTX et de 4-AP a indiqué que les connexions vGlut2BF → LHb étaient monosynaptiques (Fig. 1g – i). Cette réponse a été abolie en présence des antagonistes des récepteurs AMPA et NMDA CNQX et APV, indiquant une réponse glutamatergique (Fig. 1g, h). Collectivement, ces données montrent que les cellules vGlut2LHb reçoivent une innervation robuste des neurones vGlut2BF et que ces nœuds sont connectés de manière monosynaptique.

En plus de provoquer la suppression et l'aversion de l'alimentation, les neurones vGlut2BF répondent également à divers stimuli sensoriels, y compris les signaux olfactifs aversifs et liés à l'alimentation12,17,18. Étant donné que le BF et le LHb sont fonctionnellement connectés, nous avons ensuite cherché à déterminer si les projections du BF vers le LHb ou les neurones au sein du LHb lui-même répondent aux informations sensorielles. En raison de l'abondance et de la diversité des odorants volatils, et parce que certaines odeurs sont connues pour être intrinsèquement aversives, appétissantes ou gratifiantes pour les souris, nous avons présenté des stimuli olfactifs tout en enregistrant l'activité neuronale des terminaisons axonales vGlut2BF dans le LHb. Pour cela, nous avons ciblé l'expression de GCaMP8 Cre-dépendant (rAAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s) sur les neurones vGlut2BF et effectué une photométrie des fibres dans le LHb alors que nous présentions soit des odeurs alimentaires appétitives19,20, soit des odeurs naturellement aversives (urine de renard, aliments pourris). odeur et traces d'amines19,21) à l'aide d'un olfactomètre à flux continu décrit précédemment (Fig. 2a, b, Supp. Fig. 2a22). Les odeurs ont été présentées pendant 2 s chacune, en répétitions de 10 avec un ordre aléatoire, et 18 s entre la présentation des odeurs.

Les projections glutamatergiques BF à LHb et les cellules LHb recevant l'entrée BF répondent aux stimuli sensoriels aversifs et liés à l'alimentation. (a) Configuration expérimentale pour les enregistrements de photométrie à fibre. ( b ) Configuration expérimentale pour l'enregistrement des terminaux d'axone vGlut2BF dans le LHb et image représentative du ciblage par fibre optique (Bregma - 1, 58). ( c ) Traces dF / F moyennes du score z des terminaisons axonales vGlut2BF → LHb (en noir) sur les réplicats biologiques (n = 12). Le contour gris représente l'IC à 95 %. La case rose représente la diffusion d'odeur de 2 s. La carte thermique montre chaque présentation d'une odeur donnée (10 répétitions par odeur) sur les 12 souris. Jaune = 1 (activité maximale), bleu foncé = 0 (activité minimale). Carte thermique générée par MATLAB (version R2019a ; https://www.mathworks.com/products/matlab.html). ( d ) Réponse olfactive moyenne des terminaux BF enregistrée à l'aide de la photométrie à fibre. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 12. Réponses olfactives moyennes du z-score dF/F : huile minérale = 0,19 ± 0,22 (p = 0,41), urine de renard = 0,74 ± 0,22 (p = 0,0070), Chow = 0,79 ± 0,35 (p = 0,048), méthylbutylamine = 0,80 ± 0,36 (p = 0,047), Cadaverine = 0,73 ± 0,23 (p = 0,0087), Acide butyrique = 0,84 ± 0,28 (p = 0,013). (e) Zone moyenne de réponse aux odeurs sous la courbe (AUC) des terminaux BF enregistrée à l'aide de la photométrie à fibre. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 12. ASC moyenne des réponses olfactives dF/F du score z : huile minérale = 78,61 ± 80,24 (p = 0,35), urine de renard = 273,0 ± 82,50 (p = 0,0070), Chow = 289,1 ± 131,1 (p = 0,049) , Méthylbutylamine = 302,0 ± 127,6 (p = 0,037), Cadaverine = 256,9 ± 85,95 (p = 0,012), Acide butyrique = 312,7 ± 103,5 (p = 0,012). ( f ) Configuration expérimentale pour les enregistrements de photométrie par fibre de cellules LHb recevant une entrée BF à l'aide d'AAV1-Cre et d'une image représentative du ciblage par fibre optique (Bregma - 1, 58). ( g ) Moyenne des traces dF / F du score z des cellules LHb recevant une entrée BF (en noir) dans les répétitions biologiques (n = 6). Le contour gris représente l'IC à 95 %. La case rose représente la diffusion d'odeur de 2 s. La carte thermique montre chaque présentation d'une odeur donnée (10 répétitions) sur les 6 souris. Jaune = 1 (activité maximale), bleu foncé = 0 (activité minimale). Carte thermique générée par MATLAB (version R2019a ; https://www.mathworks.com/products/matlab.html). ( h ) Réponse olfactive moyenne des cellules LHb recevant une entrée BF enregistrée à l'aide de la photométrie à fibre. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 6. Réponses olfactives moyennes du z-score dF/F : Huile minérale : − 0,14 ± 0,34 (p = 0,69), urine de renard = 0,85 ± 0,29 (p = 0,033), Chow = 1,83 ± 0,10 (p = < 0,0001) , Méthylbutylamine = 1,78 ± 0,18 (p = 0,0002), Cadaverine = 1,66 ± 0,21 (p = 0,0006), Acide butyrique = 1,54 ± 0,24 (p = 0,0013). ( i ) Aire de réponse moyenne des odeurs sous la courbe (AUC) des cellules LHb recevant une entrée BF enregistrée à l'aide de la photométrie à fibre. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 6. ASC moyenne des réponses olfactives du z-score dF/F : huile minérale = − 51,10 ± 123,3 (p = 0,70), urine de renard = 306,0 ± 103,0 (p = 0,031), Chow = 680,9 ± 37,48 (p = < 0,0001), Méthylbutylamine = 652,9 ± 66,78 (p = 0,0002), Cadaverine = 604,0 ± 76,99 (p = 0,0005), Acide butyrique = 553,7 ± 95,45 (p = 0,0021).

Lors de l'émission d'odeurs, les terminaux vGlut2BF → LHb ont répondu aux odeurs aversives et liées à la nourriture, mais pas aux témoins d'huile minérale (Fig. 2c). La quantification des enregistrements photométriques, comprenant à la fois la réponse olfactive moyenne et l'aire moyenne sous la courbe (AUC), a révélé que les neurones vGlut2BF → LHb étaient activés à des niveaux similaires par les odeurs de nourriture et les odeurs naturellement aversives (Fig. 2d, e, Supp. Fig. 3 ). Par exemple, en comparant les valeurs de score z soustraites de base des réponses d'odeur moyennes, les terminaux vGlut2BF → LHb ont montré une fluorescence accrue de 0,80 ± 0,36 (p = 0,047) à l'amine trace méthylbutylamine, et augmentée de 0,79 ± 0,35 (p = 0,048) pour chow odorant (Fig. 2d). Les projections de VGlut2BF vers le LHb étaient moins susceptibles de répondre aux odeurs neutres et ne répondaient pas au beurre de cacahuète odorant alimentaire appétissant et agréable au goût (Supp. Fig. 4). Ainsi, les projections vGlut2BF vers la LHb semblent répondre à la fois aux informations sensorielles aversives et appétitives. Compte tenu des réponses larges des terminaux vGlut2BF → LHb, nous nous sommes ensuite demandé dans quelle mesure les neurones de la LHb reçoivent et répondent directement à ces informations sensorielles. Pour cela, nous avons ciblé stéréotaxiquement un Cre transsynaptique antérograde (rAAV1-hSyn-Cre)23 sur le BF d'animaux de type sauvage (C57BL/6NJ), tout en injectant et en implantant simultanément le LHb avec des GCaMP8 Cre-dépendants (rAAV-Synapsin-flex- jGCaMP8s) et un implant à fibre optique pour les enregistrements photométriques (Fig. 2f, Supp. Fig. 2b). Cela nous a permis d'enregistrer à partir de cellules cibles LHb qui reçoivent une entrée synaptique BF. Conformément à ce que nous avons observé à partir des réponses photométriques dans les terminaux vGlut2BF, nous avons noté des réponses olfactives robustes aux odeurs aversives et liées à la nourriture dans les neurones LHb (Fig. 2g – i, Supp. Fig. 5). Par exemple, en comparant les valeurs de score z soustraites de base des réponses olfactives moyennes, les cellules LHb ciblées par AAV1-Cre dans le BF ont montré une fluorescence accrue de 1,78 ± 0,18 (p = 0,0002) à l'amine trace méthylbutylamine, et de 1,83 ± 0,10 ( p = <0,0001) pour manger l'odorant (Fig. 2h). Les cellules LHb recevant un apport de BF semblaient également répondre à plusieurs odeurs neutres et au beurre de cacahuète odorant alimentaire appétissant (Supp. Fig. 6). Ainsi, les projections vGlut2BF → LHb relaient un large éventail d'informations sensorielles, y compris des signaux appétitifs / alimentaires et aversifs à la LHb, qui répond également à divers stimuli olfactifs.

Nous avons identifié le BF glutamatergique comme un nœud majeur dans la suppression de l'apport alimentaire et l'aversion, et avons montré que les neurones vGlut2BF envoient des projections robustes au LHb. Ainsi, nous avons cherché à déterminer si la connectivité vGlut2BF → LHb module l'alimentation. Pour cela, nous avons ciblé stéréotaxiquement un AAV exprimant la Channelrhodopsin2-EYFP dépendante de Cre (rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP)24, ou la GFP dépendante de Cre comme contrôle (rAAV-EF1α-flex-GFP) pour le BF des animaux vGlut2-Cre+/-. ChR2-EYFP, qui est lié à la membrane, a marqué de manière robuste les projections BF → LHb de la même manière que le marquage synaptophysine :: mRuby2 (Fig. 1d). Cependant, étant donné que ChR2 est localisée sur la membrane, des fibres de passage du BF au LHb ont également été visualisées passant par le thalamus. Des fibres optiques ont été implantées sur la LHb pour stimuler sélectivement les terminaux vGlut2BF exprimant ChR2 dans la LHb (Fig. 3a, b, Supp. Fig. 7).

L'activation des neurones glutamatergiques du cerveau antérieur basal glutamatergiques projetant l'habénule latérale réduit l'apport alimentaire et entraîne l'aversion. ( a ) Configuration expérimentale pour le comportement optogénétique in vivo, dans laquelle les terminaux vGlut2BF de la LHb sont activés. (b) Images représentatives montrant un implant à fibre optique ciblant les terminaux BF dans le LHb. Images prises à Bregma − 1.46. ii) Encart zoomé. ( c ) Chronologie expérimentale pour le test de réalimentation avec et sans stimulation optogénétique des cellules vGlut2BF → LHb. Apport alimentaire moyen (g) de chow mesuré à des intervalles de 5 min stim/no stim pendant toute la durée d'une expérience de réalimentation de 20 min. Les symboles pleins représentent les valeurs moyennes, tandis que les symboles creux/transparents représentent les valeurs individuelles des répliques biologiques. Signification statistique calculée à l'aide d'une ANOVA bidirectionnelle à mesures répétées avec correction de Sidak pour les comparaisons multiples. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 7. À 5 min période de temps stim : contrôles GFP = 0,12 ± 0,021 g, animaux ChR2 = 0,05 ± 0,019 g, p = 0,0078. À 10 min de période de non-stim : contrôles GFP = 0,07 ± 0,008 g, ChR2 = 0,100 ± 0,018 g, p = 0,6608. À une période de temps de stimulation de 15 min : contrôles GFP = 0,07 ± 0,016 g, CHR2 = 0,03 ± 0,008 g, p = 0,2345. À 20 min de période de temps non stim : contrôles GFP = 0,06 ± 0,013 g, ChR2 = 0,097 ± 0,020 g, p = 0,3297. ( d ) Configuration expérimentale pour un test d'évitement de lieu en temps réel avec stimulation optogénétique. ( e ) Cartes thermiques montrant le mouvement du témoin GFP représentatif et des souris ChR2-EYFP au cours de l'essai d'évitement de place en temps réel dans lequel les souris ont été stimulées du côté droit de la chambre. Cartes thermiques générées à l'aide du logiciel Noldus Noldus EthoVision (XT 16 ; https://www.noldus.com/ethovision-xt). ( f ) Pourcentage moyen de temps pour les contrôles GFP et les animaux exprimant ChR2-EYFP passés dans les côtés non stimulés ou stimulés de l'arène au cours d'une expérience de 20 minutes. Signification statistique déterminée à l'aide du test binomial pour la proportion avec correction de Bonferroni ; hypothèse nulle = 50 %. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 7. Pour les contrôles GFP, ils ont passé 47,68 ± 1,98 % de leur temps du côté non stim et 51,32 ± 1,97 % du côté stim, p = 0,7644. Pour ChR2 : 71,07 ± 4,70 % de temps côté non stim, 27,84 ± 4,82 % côté stim, p < 0,0001. (g) Durée moyenne de chaque visite du côté stimulation de la chambre. Signification statistique déterminée à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Contrôles GFP = 17,50 ± 3,98 s, ChR2 = 7,71 ± 1,79 s, p = 0,0447. n = 7. (h) Nombre de visites dans la zone de stimulation. Signification statistique déterminée à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. Contrôles GFP = 42,00 ± 5,52 visites, ChR2 = 56,29 ± 9,05 visites, p = 0,2026 (non significatif). n = 7.

Pour tester l'effet de l'activation de vGlut2BF → LHb sur le comportement alimentaire, les souris ont été mises à jeun toute la nuit puis stimulées avec une lumière de 470 nm à 20 Hz (la fréquence de décharge maximale des neurones vGlut2BF25) avec des impulsions de 5 ms pendant 5 min, suivies de 5 min de périodes d'arrêt. tout en étant présenté avec de la nourriture. La consommation alimentaire a été mesurée toutes les 5 min pendant un total de 20 min (Fig. 3c). Les souris exprimant ChR2 ont considérablement réduit leur consommation de nourriture d'environ 50% pendant les périodes de photostimulation, mais ont consommé autant de nourriture que les animaux témoins pendant les périodes sans photostimulation (Fig. 3c; les souris ChR2-EYFP ont consommé 0, 05 ± 0, 02 g de nourriture, tandis que les témoins GFP consommaient 0,12 ± 0,02 g dans le premier épisode de stimulation (p = 0,0078)). Ainsi, l'activation sélective des terminaux vGlut2BF → LHb a empêché de manière transitoire et significative la prise de nourriture chez les animaux à jeun, mais immédiatement après l'arrêt de la photostimulation, le comportement alimentaire normal sans relâche a repris.

Puisqu'il a été démontré que le BF glutamatergique induisait l'aversion12,26, nous avons ensuite demandé si l'activation optogénétique des terminaux vGlut2BF → LHb induisait un comportement aversif. Pour tester cela, nous avons soumis des souris optogénétiques implantées de LHb (Fig. 3a, b) à un test d'évitement de lieu en temps réel, dans lequel les souris étaient photostimulées (20 Hz, impulsions de 5 ms) dans la moitié d'une arène non marquée (Fig. 3d). Les souris ont été enregistrées sur vidéo et le temps passé dans l'une ou l'autre moitié de l'arène a été analysé post hoc. Les souris témoins exprimant la GFP ont passé un temps égal des deux côtés de la chambre (51,32 ± 1,97 % du côté stimulation, 47,68 ± 1,98 % du côté non-stimulation, p = 0,7644). Cependant, les souris exprimant ChR2 ont montré une aversion évidente pour la zone de l'arène programmée pour la photostimulation des circuits vGlut2BF → LHb, passant beaucoup moins de temps du côté stimulation par rapport au côté non-stimulation (27,84 ± 4,82 % du côté stimulation, 71,1 ± 4,7 % du côté sans stimulation, p = < 0,0001 ; Fig. 3e, f). De plus, la durée moyenne de la visite du côté stimulation était significativement plus courte pour les souris ChR2 par rapport aux témoins GFP (7, 71 ± 1, 79 s pour les souris ChR2-EYFP, 17, 5 ± 3, 98 s pour les témoins GFP, p = 0, 0447; Fig. 3g). Cependant, les témoins GFP et les souris ChR2-EYFP ont eu un nombre similaire de visites dans la zone de stimulation (Fig. 3h), indiquant que les souris ChR2 ont continué à s'aventurer dans la zone de stimulation malgré l'aversion provoquée. Ensemble, ces observations suggèrent que les circuits vGlut2BF → LHb entraînent une aversion manifeste en temps réel, car les souris ChR2 passent globalement moins de temps et effectuent des visites plus courtes dans la zone de stimulation lors d'un test d'évitement de lieu en temps réel.

En raison du phénotype d'aversion dramatique observé avec l'activation des circuits vGlut2BF → LHb, nous nous sommes ensuite demandé si ces circuits conduiraient à des réponses aversives apprises après conditionnement associatif. Pour tester cela, nous avons activé optogénétiquement les neurones vGlut2BF → LHb lorsque les animaux se trouvaient dans la moitié d'une arène contenant un marqueur contextuel (murs avec un motif rayé; Fig. 4a), et avons ensuite mesuré leur capacité à associer le signal à l'aversion photostimulée de vGlut2BF. → Circuit LHb. Pour cela, les souris ont été entraînées pendant 20 minutes par jour, trois jours de suite en utilisant un paradigme d'aversion à l'endroit conditionné (Fig. 4a). Le jour du test (jour 4), les animaux ont été placés dans la même chambre que les jours précédents mais n'ont pas été soumis à la photostimulation. L'activité totale a été enregistrée pendant 20 minutes et le temps passé de chaque côté de la chambre a été analysé post hoc. Bien qu'elles aient été opposées à la photostimulation lors d'un test d'évitement de lieu en temps réel (Fig. 3d – h), les souris n'ont pas appris à éviter le côté marqué d'une arène le jour du test après l'entraînement de préférence de lieu conditionné et ont passé près de 50% de leur temps. temps dans l'une ou l'autre moitié de l'arène (Fig. 4b ; les souris ChR2-EYFP ont passé 46,43 ± 3,96 % de leur temps du côté non rayé et 50,78 ± 4,07 % de leur temps du côté rayé/précédemment stimulé, p = 0,6137) . En tant que contrôle positif pour vérifier que les souris optogénétiques vGlut2BF → LHb n'avaient pas de formation de mémoire altérée en raison des implants de fibres invasives et / ou de l'injection virale, nous avons effectué un conditionnement contextuel de la peur à l'aide d'un choc au pied sans photostimulation (Supp. Fig. 8a). Toutes les souris ont présenté une augmentation significative du pourcentage de temps de congélation dans la chambre de conditionnement par choc au pied à la fois 2 et 24 h après le conditionnement (Supp. Fig. 8b), indiquant que les souris optogénétiques vGlut2BF → LHb ont des circuits d'apprentissage et de mémoire intacts.

La stimulation optogénétique des circuits basaux du cerveau antérieur vers l'habenula latéral altère la formation de la mémoire. ( a ) Paradigme expérimental contextuel de préférence de lieu conditionné avec stimulation optogénétique. ( b ) Pourcentage moyen de temps passé par les animaux optogénétiques GFP et ChR2-EYFP de part et d'autre de l'arène contextuelle de préférence de lieu conditionné le jour du test, sans photostimulation. Signification statistique déterminée à l'aide du test binomial pour la proportion avec correction de Bonferroni ; hypothèse nulle = 50 %. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 7. Pour les contrôles GFP, ils ont dépensé 48,66 ± 2,798 % dans la zone non stim, 48,7 ± 2,83 % dans la zone stim, p = 0,99. Pour les animaux ChR2, ils ont dépensé 46,43 ± 3,958 % du côté non stim, 50,78 ± 4,07 % du côté stim, p = 0,6137. (c) Nouveau paradigme expérimental de reconnaissance d'objets. Dans la version de photostimulation de ce paradigme, les souris ont été photostimulées (20 Hz, impulsions de 5 ms) pendant 10 min après une séance d'entraînement de 10 min avec deux objets identiques. Un jour plus tard, des souris ont été testées sur leur capacité à faire la distinction entre un roman et un objet familier. (d) Indice de discrimination (calculé comme suit : [(temps d'investigation d'un nouvel objet - temps d'investigation d'un objet familier)/temps d'investigation total]*100) le jour du test de reconnaissance d'un nouvel objet. Un indice de discrimination supérieur à 0 indique une préférence pour l'étude d'un nouvel objet, comme prévu. DI pour la stimulation GFP = 33,53 ± 3,80 %. DI pour la stimulation ChR2 = 0,049 ± 7,38 %. DI pour GFP sans stimulation = 33,91 ± 7,13 %, DI pour ChR2 sans stimulation = 28,55 ± 4,29 %. Signification statistique calculée à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs à mesures répétées avec une correction de comparaisons multiples de Bonferroni. Stimulation GFP vs stimulation ChR2 p = 0,0023. GFP sans stim vs ChR2 sans stim p => 0,9999. ChR2 stim vs ChR2 sans stim p = 0,0113. GFP stim vs GFP sans stim p => 0,9999.

En raison de l'absence de préférence de lieu conditionnée malgré la puissante aversion produite par la stimulation optogénétique des circuits vGlut2BF → LHb, nous nous sommes demandé si ces circuits contournaient l'apprentissage et la mémoire d'un état et/ou d'un emplacement aversifs, ou s'ils perturbaient potentiellement la formation de la mémoire. Pour tester cela, nous avons effectué une nouvelle tâche de mémoire de reconnaissance d'objets dans laquelle la présentation d'objets était suivie d'une stimulation optogénétique (pour ne pas confondre le processus de formation). Fait intéressant, les souris exprimant ChR2 n'ont pas discriminé un objet "familier" d'un nouvel objet, avec un indice de discrimination de 0,049 ± 7,38 %, indiquant que la stimulation des circuits vGlut2BF → LHb bloque la formation de la mémoire. Cet effet était réversible, car les mêmes animaux discriminaient de manière adéquate les objets nouveaux et familiers lorsqu'ils étaient entraînés sans photostimulation (Fig. 4c, d). Ensemble, ces données montrent que si les circuits vGlut2BF → LHb médient une aversion puissante, cette aversion n'est pas formée dans une mémoire et ne peut pas être associée à des signaux contextuels comme de nombreux autres types de comportements aversifs. De plus, la stimulation de ce circuit après l'entraînement inhibe activement la formation de la mémoire.

En raison du phénotype d'aversion dramatique observé avec l'activation des neurones vGlut2BF → LHb, nous avons ensuite demandé si l'activation de ce circuit favorisait une réponse de type stress ou combat ou fuite typique d'autres états hautement aversifs. Pour tester cela, nous avons dosé les niveaux des hormones plasmatiques ACTH, corticostérone, norépinéphrine et épinéphrine après l'activation optogénétique des neurones vGlut2BF → LHb. Le sang a été prélevé au départ (sans stimulation optogénétique), immédiatement après 5 min de photostimulation pour détecter des réponses de combat ou de fuite à action rapide, et 20 min après une période de photostimulation de 5 min pour identifier toute réponse potentielle au stress à action plus lente. Chaque point temporel était séparé de 2 semaines pour permettre une récupération complète et pour éviter de confondre les points temporels ultérieurs (Fig. 5a). Après avoir isolé le plasma du sang total prélevé, nous avons mesuré l'ACTH et la corticostérone par radioimmunoessais, et les catécholamines par HPLC. Il est important de noter qu'il n'y avait aucune différence dans les niveaux d'hormones entre les témoins GFP et les animaux expérimentaux ChR2-EYFP au départ (sans stimulation optogénétique; Fig. 5b). Fait intéressant, nous n'avons détecté aucune différence majeure entre les témoins GFP et les souris ChR2-EYFP dans aucune des hormones mesurées immédiatement après la stimulation ou 20 minutes après la stimulation (Fig. 5c, d). En fait, certaines hormones, telles que l'épinéphrine, ont présenté une réduction des niveaux au cours de l'expérience, mais cet effet a été observé dans les groupes GFP et ChR2-EYFP, indiquant potentiellement une acclimatation à la procédure de prélèvement sanguin (Fig. 5d). Ainsi, l'activation des neurones vGlut2BF → LHb provoque un comportement aversif robuste sans induire de stress ou de réponse de combat ou de fuite. Parallèlement à la preuve que cet état aversif photo-évoqué ne peut pas être contextualisé et altère la mémoire (Fig. 4), ces données suggèrent que les circuits vGlut2BF → LHb induisent une réponse d'aversion instantanée, "de type réflexe".

L'aversion provoquée par l'activation de l'habénule basale du prosencéphale vers l'habenula latéral n'évoque pas de réponse au stress. ( a ) Paradigme expérimental pour la collecte de plasma au départ, après la stimulation et 20 minutes après la stimulation. Chaque point temporel séparé de 2 semaines. ( b ) Niveaux d'hormones de base pour toutes les hormones mesurées pour les témoins GFP et les animaux ChR2-EYFP. Tests statistiques utilisant plusieurs tests t non appariés. Les barres d'erreur représentent SEM. n = 6 pour les contrôles GFP, n = 7 pour les animaux ChR2-EYFP. Pour l'ACTH : contrôles GFP = 504,03 ± 158,94 pg/mL, animaux ChR2 = 444,82 ± 146,80 pg/mL (p = 0,9799). Pour la corticostérone : contrôles GFP = 437,74 ± 93,38 ng/mL, animaux ChR2 = 376,45 ± 60,59 ng/mL (p = 0,9111). Pour l'épinéphrine : Contrôles GFP = 677,17 ± 115,04 pg/mL, animaux ChR2 = 639,29 ± 126,13 pg/mL (p = 0,9950). Pour la noradrénaline : Contrôles GFP = 873,17 ± 89,83 pg/mL, animaux ChR2 = 719,29 ± 94,81 pg/mL (p = 0,6007). ( c ) Niveaux d'hormones au départ, après la stimulation et 20 minutes après la stimulation pour les hormones de réponse au stress ACTH et corticostérone. Signification statistique déterminée à l'aide de mesures répétées ANOVA à deux facteurs avec une correction de Sidak pour les comparaisons multiples. n = 6 pour les contrôles GFP, n = 7 pour les animaux ChR2-EYFP Pour l'ACTH : contrôles GFP au départ = 504,03 ± 158,94 pg/mL, animaux ChR2-EYFP au départ = 444,82 ± 145,80 pg/mL, p = 0,9799. Contrôles GFP post stim = 586,11 ± 129,50 pg/mL, ChR2-EYFP post stim = 719,61 ± 77,57 pg/mL, p = 0,8197. Contrôles GFP 20 min post stim = 630,24 ± 98,01 pg/mL, ChR2-EYFP 20 min post stim = 628,4 ± 89,46 pg/mL, p = > 0,999. Pour la corticostérone : contrôles GFP au départ = 437,74 ± 93,38 ng/mL, animaux ChR2-EYFP au départ = 376,45 ± 60,59 ng/mL, p = 0,9111. Contrôles GFP post stim = 409,17 ± 92,20 ng/mL, ChR2-EYFP post stim = 455,90 ± 84,11 ng/mL, p = 0,9575. GFP contrôle 20 min post stim = 306,86 ± 58,40 ng/mL, ChR2-EYFP 20 min post stim = 381,12 ± 33,80 pg/mL, p = 0,8541. ( d ) Niveaux d'hormones au départ, après la stimulation et 20 minutes après la stimulation pour les hormones de combat ou de fuite, l'épinéphrine et la noradrénaline. Signification statistique déterminée à l'aide de mesures répétées ANOVA à deux facteurs avec une correction de Sidak pour les comparaisons multiples. n = 6 pour les contrôles GFP, n = 7 pour les animaux ChR2-EYFP. Pour l'épinéphrine : contrôles GFP au départ = 677,17 ± 115,04, animaux ChR2-EYFP au départ = 639,29 ± 126,13, p = 0,9950. Contrôles GFP post stim = 365,50 ± 37,82, animaux ChR2-EYFP post stim = 514,14 ± 53,00, p = 0,1278. Contrôles GFP 20 min post stim = 364,50 ± 39,10, animaux ChR2-EYFP 20 min post stim = 438,00 ± 45,31, p = 0,5698. Pour la noradrénaline : contrôles GFP au départ = 873,17 ± 89,83, animaux ChR2-EYFP au départ = 719,29 ± 94,81, p = 0,6007. Contrôles GFP après stimulation = 768,83 ± 150,05, animaux ChR2-EYFP après stimulation = 546,86 ± 42,95, p = 0,4999. Contrôles GFP 20 min post stim = 628,33 ± 87,80, animaux ChR2-EYFP 20 min post stim = 431,29 ± 58,80, p = 0,2591.

Étant donné que l'activation des circuits vGlut2BF → LHb induit un comportement d'aversion puissant et annule l'alimentation induite par la faim, nous avons ensuite demandé si l'activation optogénétique de ces circuits serait suffisante pour empêcher les souris à jeun de consommer de la nourriture riche en graisses (HF ; 60 % de graisse kcal). qui est très agréable au goût et gratifiant pour les souris. Avant l'expérience, les souris optogénétiques vGlut2BF → LHb ont été habituées à la nourriture HF en complétant leur alimentation tous les jours pendant trois jours. Les souris à jeun pendant la nuit ont ensuite été placées dans une arène où une extrémité de l'arène avait deux zones de nourriture : une avec de la nourriture régulière et l'autre avec de la nourriture HF. Lors du passage dans l'une ou l'autre des zones alimentaires, les souris à jeun recevaient une photostimulation, mais ne recevaient pas de photostimulation dans le reste de l'arène (Fig. 6a). Les souris ont été enregistrées sur vidéo et la consommation alimentaire a été mesurée pendant un total de 20 min. Comme auparavant, les souris exprimant ChR2 présentaient une forte aversion pour le côté photostimulation de la chambre et passaient la plupart de leur temps du côté non-stimulation (Fig. 6b; les souris ChR2 passaient 78,29 ± 1,89% de leur temps dans le côté non-stimulation contre 11,98 ± 1,60 % de leur temps du côté stimulation/alimentation, p = < 0,0001). Les souris ChR2 ont également passé beaucoup moins de temps par visite du côté stimulation de la chambre (Fig. 6c ; les souris ChR2 ont passé 2,16 ± 0,33 s par visite tandis que les souris GFP ont passé 16,33 ± 2,3 s par visite, p = <0,0001), et donc moins temps dans les zones chow ou HF chow par rapport aux contrôles GFP. En fait, les souris ChR2 ont passé 2,80 ± 0,58 % de leur temps dans la zone de chow et 8,41 ± 1,30 % de leur temps dans la zone de chow HF, tandis que les témoins GFP ont passé 20,79 ± 2,74 % de leur temps dans la zone de chow et 26,73 ± 2,45 % de leur temps dans la zone de chow HF (Fig. 6d). Cependant, malgré l'aversion pour la zone de photostimulation, les animaux ChR2 ont consommé la même quantité totale de nourriture normale ou HF que les témoins GFP (Fig. 6e; les souris GFP ont consommé 0, 05 ± 0, 03 g de nourriture et 0, 53 ± 0, 05 g de nourriture HF tandis que les souris ChR2 consommaient 0,03 ± 0,01 g de nourriture et 0,36 ± 0,09 g de nourriture HF). Notamment, les souris ChR2 ont effectué des visites beaucoup plus courtes dans les zones de chow ou de chow HF (Fig. 6f) et ont parcouru une distance totale plus longue que les témoins GFP (Fig. 6g). Ainsi, les souris ChR2 ont adapté leur stratégie de recherche de nourriture pour effectuer des trajets plus courts vers les zones alimentaires, en évitant la photostimulation entre les périodes d'alimentation. Les souris ChR2 ont également fait plus de voyages de manière disproportionnée dans la zone de chow HF (Fig. 6h). Ces données suggèrent que sous la pression de la photostimulation vGlut2BF → LHb liée à l'aversion, les animaux ChR2 choisissent de rechercher des aliments plus riches en calories et plus gratifiants. De plus, les souris ChR2 ont consommé la même quantité de nourriture que les témoins GFP en moins de temps en effectuant des trajets plus courts mais plus fréquents vers la zone alimentaire et en consommant de la nourriture à un rythme plus rapide. Si ces données montrent partiellement la flexibilité comportementale des souris pour obtenir efficacement de la nourriture face à une pression externe, elles révèlent également une distinction fondamentale : alors que l'aversion suscitée par les circuits vGlut2BF→LHb est suffisante pour réduire le temps passé à interagir avec la nourriture et réduit fortement la prise alimentaire. (Fig. 3), l'activation transitoire de ce circuit n'affecte pas l'appétit. Autrement dit, les circuits vGlut2BF → LHb entraînent une aversion qui peut remplacer le comportement alimentaire lorsqu'il est activé, mais cette activation elle-même ne réduit pas l'appétit ou la motivation à manger.

L'activation des neurones glutamatergiques basaux du cerveau antérieur projetant l'habénule latérale annule l'envie de manger, mais n'affecte pas l'appétit. ( a ) Configuration expérimentale pour la stimulation optogénétique des neurones vGlut2BF → LHb associés à de la nourriture. ( b ) Pourcentage moyen de temps pour les contrôles GFP et les animaux ChR2-EYFP passés dans les parties de stimulation ou de non-stimulation de l'arène au cours d'une expérience de 20 minutes. Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide du test binomial pour la proportion avec correction de Bonferroni ; hypothèse nulle = 50 %. n = 7. Les témoins GFP ont passé 43,00 ± 3,45 % de temps du côté non-stimulation et 50,71 ± 3,22 % de temps du côté stimulation/alimentation (p = 0,4705). Les animaux ChR2-EYFP ont passé 78,29 ± 1,89 % de temps du côté non-stimulation contre 11,98 ± 1,60 % de temps du côté stimulation/nourriture (p = < 0,0001). ( c ) La durée moyenne de chaque visite du côté stimulation de la chambre pour les animaux GFP et ChR2-EYFP. Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. n = 7. Les animaux GFP ont dépensé 16,33 ± 2,3 s par visite. Les animaux ChR2-EYFP ont dépensé 2,157 ± 0,33 s par visite. p = < 0,0001. ( d ) Le pourcentage de temps que les contrôles GFP et les animaux ChR2-EYFP ont passé à interagir avec un chow ou un chow riche en graisses (dans la partie stimulation de l'arène). Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide de l'ANOVA à deux facteurs avec une correction de Tukey pour les comparaisons multiples. n = 7. Dans la zone chow : les témoins GFP ont passé 20,79 ± 2,74 % de temps, les animaux ChR2-EYFP ont passé 2,80 ± 0,58 % de temps (p = <0,0001). Dans la zone de nourriture riche en graisses : les témoins GFP ont passé 26,73 ± 2,45 % de temps, les animaux ChR2-EYFP ont passé 8,41 ± 1,3 % de temps (p = <0,0001). ( e ) Apport alimentaire cumulé moyen des témoins GFP et des animaux ChR2-EYFP tout au long de l'expérience de 20 minutes. Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide de l'ANOVA à deux facteurs avec correction de Tukey pour les comparaisons multiples. n = 7. Chow consommé : témoins GFP = 0,05 ± 0,03 g, animaux ChR2-EYFP = 0,03 ± 0,01 g (p = 0,9888). Aliments HF consommés : témoins GFP = 0,53 ± 0,05 g, animaux ChR2-EYFP = 0,36 ± 0,09 g (p = 0,1640). Chow GFP vs Chow GFP HF : p = < 0,0001. Chow ChR2 vs Chow ChR2 HF : p = 0,0013. (f) La durée moyenne de chaque visite dans les zones de chow ou de chow riche en graisses pour les contrôles GFP et les animaux ChR2-EYFP. Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide de l'ANOVA à deux facteurs avec correction de Tukey pour les comparaisons multiples. n = 7. Visite moyenne de la zone de chow : contrôles GFP = 7,11 ± 0,97 s, animaux ChR2-EYFP = 1,43 ± 0,25 s (p = < 0,0001). Visite moyenne dans la zone de chow riche en graisses : contrôles GFP = 8,49 ± 1,10 s, animaux ChR2-EYFP = 2,14 ± 0,31 s (p = <0,0001). ( g ) La distance moyenne parcourue par les témoins GFP et les animaux ChR2-EYFP au cours de l'expérience de choix alimentaire de 20 minutes. Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide d'un test t bilatéral non apparié. n = 7. Contrôles GFP = 45,66 ± 9,94 m, animaux ChR2-EYFP = 82,21 ± 28,33 (p = 0,0074). (h) Le nombre moyen de visites dans les zones de chow ou de chow riche en graisses de l'arène pour les contrôles GFP et les animaux ChR2-EYFP. Les barres d'erreur représentent SEM. Signification statistique déterminée à l'aide de l'ANOVA à deux facteurs avec correction de Tukey pour les comparaisons multiples. n = 7. Déplacements vers la zone de chow : contrôles GFP = 41,43 ± 3,36, ChR2-EYFP = 27,14 ± 2,42 (p = 0,0286). Voyages dans une zone de nourriture riche en graisses : témoins GFP = 44,7 ± 3,1, animaux ChR2-EYFP = 55,57 ± 4,31 (p = 0,1285). Comparaison du chow GFP au chow GFP HF : p = 0,8987. Comparaison du chow ChR2-EYFP avec le chow ChR2-EYFP HF : p = < 0,0001.

Alors que la channelrhodopsine révèle si un circuit est suffisant pour un comportement particulier, nous avons également testé la nécessité d'un circuit vGlut2BF → LHb pour l'aversion et le comportement d'alimentation par inhibition optogénétique, en ciblant l'archaerhodopsine Cre-dépendante (ArchT-GFP) sur le BF et la fibre optique sur le LHb d'animaux vGlut2-Cre+/- pour inhiber les terminaisons vGlut2BF→LHb. Des expériences électrophysiologiques ont validé que la photoinhibition des terminaux BF induite par ArchT inhibe efficacement la transmission synaptique aux cellules cibles LHb (Supp. Fig. 9; voir méthodes). Lors de la réalisation d'essais comportementaux in vivo, l'inhibition optogénétique des terminaux vGlut2BF → LHb n'a pas entraîné de phénotype de préférence de lieu en temps réel, ni n'a affecté l'apport alimentaire dans un essai de réalimentation (Supp. Fig. 10 et 11). En raison de la redondance des circuits d'alimentation et d'aversion dans le cerveau, il est probable que les circuits vGlut2BF → LHb soient suffisants, mais pas singulièrement nécessaires, pour réguler correctement les comportements d'alimentation et d'aversion. Néanmoins, nos données identifient clairement un circuit d'aversion capable de passer outre la consommation pulsionnelle de manière rapide et réflexive.

Dans cette étude, nous avons identifié que les neurones vGlut2BF se projettent de manière robuste vers la LHb, un centre d'aversion important du cerveau. En utilisant la photométrie des fibres et l'imagerie calcique in vivo, nous avons constaté que les circuits vGlut2BF → LHb répondent à diverses informations sensorielles, y compris des signaux sensoriels aversifs et liés à l'alimentation. En utilisant l'optogénétique, nous avons observé que les projections vGlut2BF → LHb entraînent une aversion robuste et remplacent la consommation alimentaire sans affecter l'appétit. Cette aversion n'a pas été rappelée après le conditionnement, et n'a pas non plus déclenché de stress ou de réaction de combat ou de fuite. L'activation des circuits vGlut2BF → LHb a également altéré la formation de la mémoire. Par conséquent, ce circuit d'aversion BF à LHb agit instantanément d'une manière réflexe (Fig. 7).

Résumé graphique. Les informations sensorielles olfactives sont relayées au LHb via les circuits glutamatergiques BF pour conduire des comportements aversifs, remplaçant les comportements appétitifs tels que l'alimentation.

Le cerveau antérieur basal est un nœud remplissant diverses fonctions, notamment le traitement sensoriel, l'attention, la motivation, l'apprentissage et la mémoire18,25,28,29,30,31,32,33,34,35. Auparavant, nous et d'autres avons indépendamment révélé que le BF avait un rôle dans la suppression de l'appétit et les comportements aversifs12,13,14,26. L'une des façons dont le BF peut entraîner des comportements distincts est à travers ses projections différentielles. Les cibles du BF comprennent les régions sensorielles telles que le cortex piriforme, les régions associées à l'alimentation telles que l'hypothalamus et les régions associées à la récompense/l'aversion telles que l'amygdale basolatérale, la zone tegmentale ventrale et l'habénule latérale12,13,26. Alors que cette étude s'est concentrée sur le rôle des projections de BF vers le LHb dans l'aversion et l'alimentation, des études antérieures ont montré que les projections de BF vers le LHA entraînent également l'aversion et l'hypophagie12. Le LHA est une cible particulièrement intéressante du BF car les neurones vGlut2LHA sont connus pour entraîner indépendamment l'aversion et la suppression de l'appétit10. Cependant, l'activation du champ terminal des projections vGlut2BF → LHA ne récapitule pas complètement l'aversion induite par les corps cellulaires BF. Cela indique que d'autres nœuds en aval, tels que le LHb, peuvent travailler de concert avec le LHA pour moduler de tels comportements.

La LHb est connue pour être impliquée dans les comportements d'aversion et d'évasion, est activée par le stress et la punition, ainsi que par des signaux sensoriels prédictifs de punition, et entraîne globalement un état aversif par son inhibition à la fois de la motivation et de la récompense mésolimbique dopaminergique et raphé dorsal. systèmes sérotoninergiques15,36,37,38,39,40,41,42. En ce qui concerne l'alimentation, les projections de LHA sur la LHb inhibent l'alimentation hédonique et entraînent des comportements aversifs9. Ainsi, la LHb sert de candidat de choix pour la convergence des circuits d'aversion et d'alimentation. Nous avons constaté que l'activation des projections vGlut2BF sur la LHb supprime l'envie de manger et suscite une aversion pour le lieu en temps réel. De nombreuses autres entrées de l'habenula latérale entraînent une aversion lorsqu'elles sont stimulées, notamment la zone préoptique latérale, le pallidum ventral, le septum médial et l'hypothalamus latéral9,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Des projections réciproques du LHb vers le LHA36 ont également été signalées. La connectivité réciproque entre ces deux nœuds peut synchroniser différents centres d'aversion dans le cerveau pour assurer une réponse comportementale rapide et rapide aux stimuli menaçants ou inadaptés. Le BF étant en amont et fonctionnellement connecté à la fois au LHb et au LHA, le BF pourrait fournir un contrôle synergique supplémentaire de l'aversion et faciliter cette synchronisation. Ainsi, l'interconnectivité du BF, du LHA et du LHb fournit un circuit à trois nœuds intéressant par lequel les informations aversives et appétitives sont synchronisées pour entraîner des changements rapides d'état comportemental. Il est important de noter que la plupart des manipulations de cette étude impliquaient des expériences optogénétiques de gain de fonction utilisant la channelrhodopsine pour activer les terminaisons des axones BF. Une mise en garde potentielle à cette méthode d'expérimentation est la possibilité de rétro-propagation des potentiels d'action. Cependant, les phénotypes hypophagiques de la stimulation optogénétique BF observés précédemment12 diffèrent des phénotypes d'aversion plus larges observés dans cette étude, indiquant que ce n'est probablement pas le cas dans nos expériences. De plus, l'incapacité à favoriser l'alimentation et/ou à supprimer l'aversion via l'inhibition du champ terminal dans la LHb via une stimulation ciblée de l'archaerhodopsine ne démontre pas définitivement une véritable manipulation de perte de fonction. Cela peut être que ce nœud de circuit seul n'est pas capable de contrôler de tels comportements, ou cela peut également être considéré comme un obstacle technique pour faire taire efficacement la communication à ce nœud en utilisant cette approche.

Le BF joue un rôle important dans le traitement et l'intégration sensoriels, et il a été démontré qu'il répond aux signaux sensoriels aversifs et appétitifs12,17,18,30,31,32,34. En utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés et la photométrie des fibres, nous avons observé que les projections vGlut2BF → LHb, ainsi que les cellules LHb recevant l'entrée BF, répondent à divers stimuli sensoriels. Il a déjà été démontré que la LHb est activée par divers types de stimuli sensoriels, notamment des stimuli aversifs et des signaux prédictifs aversifs, ainsi que des signaux de récompense41,44,53,54,55. Ainsi, une voie qui relaie diverses informations sensorielles au LHb est probablement via le BF.

Divers stimuli sensoriels activent à la fois les terminaux des axones vGlut2BF → LHb et les cellules LHb qui reçoivent l'entrée BF. Il est à noter qu'il est intéressant de noter que les réponses cellulaires LHb étaient beaucoup plus nettes et plus importantes que les réponses terminales BF. Cela peut être un aspect technique dû aux différences de signal sur bruit lors de l'enregistrement à partir de soma par rapport aux terminaux axonaux, ou cela peut indiquer des différences physiologiques. Par exemple, les terminaux BF peuvent être moins synchronisés dans leurs réponses aux signaux sensoriels, allongeant la réponse olfactive, tandis que les cellules LHb peuvent répondre plus uniformément et plus rapidement. Une question cruciale est de savoir si ce sont les mêmes ou différentes populations BF/LHb qui répondent respectivement aux signaux sensoriels aversifs et appétitifs. En mesurant uniquement les réponses additionnées de la population via la photométrie à fibre, il est difficile de répondre à cette question. Les deux nœuds sont composés de types de cellules hétérogènes et différentes sous-populations peuvent répondre à des stimuli gratifiants et aversifs53,56. Cependant, étant donné que ces nœuds répondent également à des odeurs neutres, il est également possible que ce circuit réponde largement, ou de manière non sélective, à des informations sensorielles. Il est possible que les circuits vGlut2BF → LHb soient activés à la fois par les odeurs alimentaires et aversives car ils modulent l'aversion et la suppression de l'apport alimentaire indépendamment, par des mécanismes distincts. De même, la réponse aux odeurs neutres peut indiquer un rôle des projections BF dans la transmission de toute information sensorielle saillante aux centres de récompense et d'aversion. Par conséquent, il sera essentiel de déterminer si les projections vGlut2BF → LHb contiennent des ensembles fonctionnellement distincts qui répondent respectivement aux signaux appétitifs ou aversifs. Ou, si les projections vGlut2BF → LHb répondent largement aux informations sensorielles, il sera essentiel de déterminer quelles autres régions du cerveau attribuent une valence à ces informations sensorielles, par exemple, via des cibles supplémentaires en aval du BF ou via d'autres entrées vers le LHb.

Les stimuli aversifs forment normalement des associations avec différents signaux sensoriels et contextuels. De plus, on s'attendrait à ce que de tels comportements aversifs drastiques entraînent une réponse au stress. L'incapacité de l'aversion vGlut2BF → LHb à être associée à des signaux contextuels ou à générer une réponse hormonale au stress est donc quelque peu surprenante. Cependant, des études indépendantes ont révélé que l'aversion provoquée par les corps cellulaires BF ne conduit pas non plus à la préférence de lieu conditionnée26, indiquant que l'aversion induite par BF ne semble pas être mémorisée. Encore plus surprenant, la stimulation optogénétique des circuits vGlut2BF → LHb après un nouvel entraînement à la reconnaissance d'objets a complètement altéré la discrimination des objets, indiquant que les circuits vGlut2BF → LHb inhibent activement la formation de la mémoire. Bien que provocateur, cela soulève la question de savoir quel serait le but évolutif d'un circuit qui entraîne une aversion instantanée et altère la consolidation de la mémoire. Peut-être que la nature réflexive et instantanée de l'aversion induite par vGlut2BF → LHb découle de la capacité de ce circuit à perturber toutes les fonctions comportementales et cognitives, facilitant une réponse aversive immédiate. Une fois que cette signalisation est absente, des fonctions cognitives telles que l'apprentissage et la mémoire, ou des comportements motivés tels que l'alimentation, peuvent s'ensuivre. D'autres études ont également indiqué que l'activation ou l'inhibition de la LHb altère le conditionnement contextuel57, donc peut-être que toute perturbation de la signalisation de la LHb est suffisante pour altérer l'apprentissage et la mémoire. Ces effets sur la mémoire s'alignent sur nos observations selon lesquelles les souris exprimant ChR2 reviennent continuellement dans une zone de photostimulation pendant les essais d'évitement de lieu en temps réel, effectuant le même nombre de voyages que les témoins GFP malgré l'aversion suscitée. Une interprétation possible de ces données est que l'activation des circuits vGlut2BF → LHb augmente l'impulsivité, ce qui rend les souris incapables d'apprendre et les amène à entrer à plusieurs reprises dans une zone aversive. Enfin, puisque les souris exprimant ChR2 reprennent une consommation alimentaire normale immédiatement après la stimulation optogénétique, l'activation des circuits vGlut2BF → LHb ne semble pas stresser l'animal, car les animaux fortement stressés perdent leur appétit58. Pris ensemble, les tests d'apprentissage et de mémoire et les données hormonales indiquent que les circuits vGlut2BF → LHb entraînent une aversion réflexive distincte des autres comportements aversifs.

Lorsqu'elles sont mises au défi de consommer de la nourriture dans une zone de photostimulation aversive, les souris optogénétiques vGlut2BF → LHb adaptent leur stratégie comportementale pour effectuer des déplacements courts mais fréquents vers une zone alimentaire afin qu'elles puissent consommer autant de nourriture que possible en peu de temps, ce qui donne une nourriture similaire. les niveaux d'apport comme témoins. Étant donné que l'apport alimentaire cumulé n'est pas affecté, cela indique que l'activation des circuits vGlut2BF → LHb inhibe l'apport alimentaire sans affecter l'appétit ou l'apport alimentaire global. Ce résultat contraste avec la suppression évidente de l'alimentation lorsque les souris sont stimulées en continu dans une arène (comme sur la figure 3c). Une explication de ces résultats contrastés est que lorsque les souris ne sont stimulées que dans une zone spécifique d'une arène, elles sont capables d'initier un comportement alimentaire dans de courts épisodes, s'échappant vers une zone de non-stimulation une fois que la photostimulation aversive est activée au maximum. D'autre part, lorsqu'elles sont photostimulées en continu, les souris ne commencent jamais à se nourrir et consomment donc moins de nourriture que les témoins GFP. Ces données appuient l'interprétation selon laquelle les circuits vGlut2BF → LHb entraînent principalement un phénotype aversif qui remplace le comportement alimentaire sans affecter l'appétit. La suppression de l'apport alimentaire est donc secondaire à un comportement aversif. Cependant, une interprétation alternative est que les circuits vGlut2BF → LHb ont des fonctions distinctes à la fois dans la suppression de l'alimentation et dans l'aversion. Cette interprétation alternative est étayée par des données de photométrie des fibres qui révèlent des réponses olfactives aux signaux alimentaires et aversifs, ainsi que des données montrant l'absence de réponse hormonale au stress après une stimulation optogénétique, car de nombreux circuits d'aversion déclenchent le combat ou la fuite et libération d'hormones de stress. Peut-être que la suppression de l'alimentation et l'aversion sont normalement analysées séparément via différents taux de déclenchement, l'ampleur de la réponse neuronale ou le recrutement de différents ensembles neuronaux. Cependant, la nature artificielle de la stimulation optogénétique, dans laquelle l'ensemble de la population BF → LHb se déclenche à une fréquence spécifique, peut masquer la signalisation physiologique vGlut2BF → LHb. Néanmoins, ces données indiquent que les circuits vGlut2BF → LHb sont suffisants pour entraîner à la fois une aversion réflexive puissante et une suppression drastique de l'alimentation.

En somme, nous avons identifié et interrogé un circuit basal du cerveau antérieur qui entraîne une puissante aversion réflexive qui l'emporte sur les comportements alimentaires. La nature réflexive de cette aversion est unique et modifie notre compréhension de la façon dont les circuits d'aversion rivalisent avec les comportements motivés pour conduire des réponses rapides aux stimuli aversifs de manière innée. De plus, cette étude fournit des informations essentielles sur la façon dont l'aversion/récompense et le traitement sensoriel interagissent avec les circuits homéostatiques pour modifier le comportement alimentaire et le poids corporel. D'un point de vue évolutif, les comportements motivés essentiels à la survie, tels que la recherche de nourriture, l'alimentation et la reproduction, doivent être équilibrés par la prudence vis-à-vis des environnements nouveaux et/ou étrangers et une prise de conscience des signaux environnementaux qui indiqueraient une récompense ou un danger. Ainsi, de nombreux circuits neuronaux d'aversion et d'échappement dans le cerveau doivent être câblés pour remplacer les circuits d'alimentation si nécessaire si une menace est présente. En étudiant le fonctionnement et l'articulation anatomique de ces circuits, on peut mieux comprendre et traiter des troubles dévastateurs tels que l'obésité et les troubles alimentaires, qui ont des effets directs majeurs sur la santé, ainsi que de nombreux autres effets secondaires néfastes59,60. De plus, en raison de l'implication de la LHb dans la toxicomanie, les troubles de l'humeur et la schizophrénie15,61, comprendre l'influence des circuits BF sur ce nœud d'aversion peut potentiellement nous aider à comprendre d'autres types de maladies mentales.

Souris:

vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl)

Source : Laboratoire Jackson

Souche # : 016963

Type sauvage C57BL/6NJ

Source : Laboratoire Jackson

Souche # : 005304

AAV :

Synaptophysine Cre-dépendante : AAV-Ef1α-flex-Synaptophysine :: mRuby2-WPRE-hGHpA

Sérotype : DJ8

Source : Centre de neuroconnectivité de l'Institut de recherche neurologique Jan et Dan Duncan

ChR2 dépendant de Cre : AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA

Sérotype : 2/9

Source : Centre de neuroconnectivité de l'Institut de recherche neurologique Jan et Dan Duncan ; plasmide sous-cloné d'Addgene #26973

mRuby dépendant de Cre : AAV-Ef1α-flex-mRuby2

Sérotype : DJ8

Source : Centre de neuroconnectivité de l'Institut de recherche neurologique Jan et Dan Duncan ; plasmide sous-cloné d'Addgene #40260

GFP dépendant de Cre : AAV-Ef1α-flex-eGFP

Sérotype : DJ8

Source : Centre de neuroconnectivité de l'Institut de recherche neurologique Jan et Dan Duncan ; plasmide sous-cloné d'Addgene #28304

GcaMP dépendant de Cre : AAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA

Sérotype : DJ8.

Source : Centre de neuroconnectivité de l'Institut de recherche neurologique Jan et Dan Duncan ; plasmide d'Addgene #10083962

AAV1-Cre : AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA

Sérotype : 2/1 (antérograde)

Source : Addgene #105553 (noyau viral U Penn)

ArchT dépendant de Cre : AAV-CAG-flex-ArchT-GFP

Sérotype : 2/9

Source : Centre de neuroconnectivité de l'Institut de recherche neurologique Jan et Dan Duncan ; plasmide d'Adddgene #28307 du laboratoire d'Edward Boyden63

Les souris utilisées dans cette étude ont été traitées conformément aux services du Département américain de la santé et des ressources humaines et à l'IACUC. Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Baylor College of Medicine et le comité d'approbation de protocole agréé BCM IACUC sous le numéro de protocole AN5596. Toutes les méthodes ont été rapportées conformément aux recommandations des lignes directrices ARRIVE. Pour toutes les expériences, des compagnons de portée mâles et femelles ont été utilisés et ont été répartis entre les groupes expérimentaux et témoins. Les souris étaient âgées d'au moins 8 semaines pour les chirurgies stéréotaxiques, et le comportement a été effectué sur des souris âgées de 3 à 5 mois. Les animaux ont été maintenus sur un cycle lumière/obscurité de 12 h et ont été logés en groupe. Les souris ont été nourries avec de la nourriture standard pour souris (Harlan, 2920X), et cette nourriture ou nourriture riche en graisses (60% de graisse kcal, Research Diets Inc 12492) a été utilisée pour des expériences d'alimentation. Des souris vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J Stock No. 01696364) ont été achetées chez Jackson Laboratories. Le génotypage de vGlut2-Cre a été effectué à l'aide des amorces suivantes de Jackson Laboratories : Mutant Reverse "ACA CCG GCC TTA TTC CAA G" (Primer 13007), Common "AAG AAG GTG CGC AAG ACG" (Primer 32667) et Wild type Reverse " CTG CCA CAG ATT GCA CTT GA" (Primaire 32668). Pour obtenir des hétérozygotes (vGlut2-Cre+/-), des souris homozygotes vGlut2-Cre (vGlut2-Cre+/+) ont été croisées avec des souris de type sauvage C57BL/6NJ (Jackson labs Stock No. 005304).

Pour toutes les chirurgies stéréotaxiques, les souris ont été anesthésiées et maintenues sous anesthésie à l'aide d'environ 1 à 3 % d'isoflurane vaporisé avec de l'oxygène. Un instrument stéréotaxique connecté au logiciel Angle Two a été utilisé pour cibler avec précision les régions du cerveau. Après avoir nivelé le crâne dans les directions ML et AP (à +/- 0,03 mm), différentes régions ont été ciblées à l'aide de coordonnées déterminées empiriquement. La coordonnée AP a été légèrement décalée vers l'avant pour s'adapter à l'inclinaison du cerveau, et les coordonnées optimisées ont été vérifiées à l'aide d'injections diI avant toute expérience de chirurgie stéréotaxique. Dans ce sens, le cerveau antérieur basal a été ciblé par des injections bilatérales de bregma, AP = 1, 18 mm, DV = - 5, 8 mm et ML = ± 1, 29 mm. Pour toutes les expériences, 150 nL de virus ont été utilisés par côté et le virus a été concentré dans les régions basales médiales du cerveau antérieur de Bregma 0,97 à Bregma 0,50. Pour les expériences de traçage anatomique, AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin :: mRuby2-WPRE-hGHpA (sérotype DJ8) a été utilisé. Pour la cartographie du circuit assistée par channelrhodopsine, AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (sérotype 2/9) a été utilisé pour l'activation assistée par la lumière, et AAV-Ef1α-flex-mRuby2 (sérotype DJ8) a été utilisé pour étiqueter les cellules à partir desquelles enregistrer. Pour la validation électrophysiologique de ArchT-GFP, AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (sérotype 2/9) a été mélangé avec AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (sérotype 2/9) comme Rapport 1:1 en volume. Pour les tests de comportement optogénétique, AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (sérotype 2/9) a été utilisé pour les animaux expérimentaux à gain de fonction, AAV-Ef1α-flex-eGFP (sérotype DJ8) a été utilisé pour les contrôles, et AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (sérotype 2/9) a été utilisé pour les expériences de perte de fonction. Pour les expériences d'imagerie calcique, AAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s-WPRE-pA (sérotype DJ8) et/ou AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA (sérotype 2/123) ont été utilisés. Tous les virus ont été titrés à au moins 1011 particules virales/µL.

Au moins deux semaines après l'injection virale, les souris ont été anesthésiées à l'aide d'isoflurane et ont été perfusées par voie transcardiaque avec du PBS suivi de 4 % de PFA (dilué à l'aide de 16 % de paraformaldéhyde EM Grade No. 15710 Electron Microscopy Sciences). Les cerveaux ont été disséqués et fixés par goutte dans du PFA à 4 % pendant une nuit à 4 ° C, suivis d'une cryoprotection pendant une nuit dans du saccharose à 20 % dans du PBS, et enfin pendant une nuit dans du saccharose à 30 % dans du PBS à 4 ° C. Les cerveaux cryoprotégés ont ensuite été inclus et congelés dans l'OCT (Fisher HealthCare n° 4585) et conservés à - 80 °C jusqu'à la section. Les cerveaux ont été tranchés coronairement dans la direction antérieure à postérieure sur un cryostat (Leica CM1860) à 40 μm pour les expériences de traçage/marquage viral et à 80 μm pour déterminer les sites d'implantation de fibres optiques post hoc. En cas de découpage à 40 μm, chaque troisième section a été collectée. Si le découpage à 80 μm, chaque section a été collectée. Après lavage avec du PBS, les tranches ont été montées sur des lames et colorées à l'aide de DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, 0100–20). Les images ont été prises à l'aide d'un microscope confocal Leica TCS SPE à 10 ou 20×, d'un microscope Leica TCS SP8 STED ou d'un microscope Leica SP8X. Toutes les images en mosaïque ont été prises à 10x. Pour la quantification du marquage synaptophysine BF :: mRuby2, trois animaux ont été analysés sur l'ensemble du cerveau, du bulbe olfactif au cervelet. Dans les régions où le marquage synaptophysin :: mRuby2 a été observé, trois images ont été prises par région (identifiées à l'aide de l'Allen Brain Atlas) sur différentes tranches d'un animal. Le signal fluorescent a été quantifié post hoc à l'aide d'Imaris, dans lequel des masques ont été dessinés sur des régions d'intérêt (ROI) et le signal de fond a été soustrait pour calculer un volume de synaptophysin :: mRuby2 terminaux divisé par le volume total du ROI. Les répliques techniques au sein d'un animal ont ensuite été moyennées pour créer une moyenne de réplique biologique, qui a été utilisée pour calculer une densité moyenne globale de synaptophysine :: mRuby2 à travers les répliques biologiques.

Des expériences d'enregistrement électrophysiologique de tranche ont été réalisées comme décrit précédemment65 avec des modifications mineures. En bref, les souris ont été profondément anesthésiées avec de l'isoflurane puis perfusées par voie transcardiaque avec une solution glacée de liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) contenant (en mM) : 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 glucose et 25 bicarbonate (pH 7,3, 295 mOsM). Les cerveaux ont été prélevés et transférés dans une solution de coupe glacée contenant (en mM) : 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 10 MgSO4, 0,5 CaCl2, 234 saccharose, 11 glucose et 26 bicarbonate. La solution de coupe a été barbotée en continu avec 95 % de CO2/5 % d'O2. Les cerveaux ont été intégrés coronairement dans de l'agarose à bas point de fusion à 1,5 %. Les cerveaux enrobés d'agar ont été immédiatement immergés dans une solution de coupe oxygénée sur un vibratome Leica VT1200. Des coupes coronales de trois cents micromètres ont été réalisées à une vitesse de coupe de 0,4 mm/s. Les tranches ont été retirées dans une chambre de récupération de tranches d'aCSF oxygéné à 37 ° C pendant au moins 30 min. Après récupération, les tranches ont été lentement ramenées à température ambiante pendant 30 minutes avant l'enregistrement.

Pour la cartographie du circuit optogénétique des entrées glutamatergiques basales du cerveau antérieur vers la LHb, les cellules vGlut2 + LHb ont été identifiées par marquage mRuby2 et ont été patchées. Les cellules patchées ont d'abord été bloquées en tension à -65 mV pour enregistrer les propriétés membranaires de base. Pour vérifier la présence d'un courant entrant évoqué par la lumière, la channelrhodopsine a été activée par un éclairage plein champ à partir d'une source de lumière au xénon filtrée filtrée (Olympus, U-N41020). Le début et la durée de la stimulation lumineuse ont été contrôlés via le logiciel ClampEx (version 10.3) par un obturateur mécanique (Sutter). Les cellules patchées ont ensuite été bloquées en tension à 0 mV (ajustées pour le potentiel de jonction) pour révéler les courants sortants. Si un courant sortant évoqué par la lumière a été observé dans l'aCSF, alors TTX (1 μM), 4AP (0,5 μM) et CNQX (10 μM /APV (50 μM) ont été appliqués en série dans un bain pour vérifier : (1) le potentiel d'action -dépendance ; (2) la nature monosynaptique ; et (3) la dépendance au récepteur du glutamate du courant évoqué.

Pour valider notre capacité à inhiber les circuits vGlut2BF→LHb via la stimulation ArchT, nous avons injecté un mélange 1:1 en volume d'AAV-CAG-flex-ArchT-GFP et AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA au BF, et des enregistrements de voltage-clamp de cellules entières ont été effectués à partir de cellules dans le LHb selon les spécifications ci-dessus. Après avoir identifié ceux qui ont répondu à la stimulation présynaptique de ChR2 dans les terminaux BF en utilisant une lumière de 470 nm, nous avons ensuite testé si l'inhibition d'ArchT supprimait le déclenchement évoqué par ChR2. Vers cela, une lumière de 565 nm a été délivrée en continu sur une période prolongée. Ensuite, pendant la photoinhibition d'ArchT, ChR2 a été stimulé séquentiellement (lumière à 470 nm) pour tester si ArchT supprimait le déclenchement évoqué par ChR2. Enfin, la stimulation ArchT a été interrompue et la stimulation ChR2 a été utilisée pour réactiver de manière réversible la cellule LHb post-synaptique.

Pour les expériences d'imagerie calcique terminale de l'axone BF, les compagnons de litière vGlut2-Cre + / - mâles et femelles ont été injectés bilatéralement avec rAAV-Syn-flex-GCaMP8s-WPRE-hGHpA62 dans le HDB en utilisant les coordonnées décrites ci-dessus. Pour l'imagerie calcique du corps cellulaire LHb, rAAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA a été injecté bilatéralement dans le HDB et rAAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA injecté dans le LHb gauche. En même temps que l'injection virale, un implant de fibre optique (noyau de 200 um avec NA = 0,50, RWD R-FOC-L200C-50NA) a été fixé sur la LHb gauche en utilisant les coordonnées de bregma AP = - 1,45, ML = - 0,45, et DV = − 2,60 en utilisant le même processus que ci-dessus. De plus, une plaque frontale en aluminium a été cimentée à la partie postérieure du crâne qui permettrait la fixation de la tête des souris sur une roue en marche pendant la présentation des odeurs. Les souris ont été autorisées à guérir et à exprimer le virus pendant 3 semaines avant que les enregistrements de photométrie sur fibre ne s'ensuivent.

Lors des enregistrements de photométrie par fibre, les souris étaient fixées sur une roue en marche avec un olfactomètre22 positionné à environ 6 cm de leur nez. Les odorants présentés comprenaient l'urine de renard (Predator Pee), la nourriture (alimentation 5V5 broyée et dissoute dans de l'huile minérale), la méthylbutylamine (Sigma 241407), la cadavérine (Sigma 52063), l'acide butyrique (Sigma B103500), le R(+)-Limonène (Sigma 183164), S(-)-Limonène (Sigma 218367), huile de rose (Rainbow Abby) et beurre de cacahuète (Justin's). Toutes les odeurs ont été dissoutes dans du minéral à une concentration de 2 % en volume et présentées en répétitions de 10, dans un ordre aléatoire. L'huile minérale seule a été utilisée comme témoin négatif. Toutes les odeurs étaient nouvelles à l'exception de l'odorant 5V5 chow.

Les enregistrements de photométrie de fibre ont été effectués en utilisant le système Doric comme décrit dans66. En bref, deux diodes électroluminescentes (longueur d'onde de 465 et 405 nm) ont été couplées à un cube de filtre par des câbles à fibres optiques (cœur de 400 um, NA = 0,48). Le cube de filtre a séparé les longueurs d'onde d'excitation et d'émission, dirigeant les longueurs d'onde d'excitation le long d'une autre fibre optique (noyau de 200 um, NA = 0,48) qui a été connectée à la fibre optique implantée sur la souris à l'aide d'un manchon de férule. Les longueurs d'onde d'émission ont été transportées de la souris au cube de filtre le long de la même fibre, puis dirigées vers un photodétecteur femtowatt (Newport) via un câble à fibre optique (cœur de 600 um, NA = 0,48). L'excitation et l'émission ont été contrôlées et enregistrées, respectivement, dans le logiciel Doric Studio. jGCaMP8s a été excité à 465 nm pour enregistrer la dynamique du calcium indiquant l'activité neuronale. En excitant simultanément à 405 nm, le point isobestique du GCaMP, nous avons collecté des émissions insensibles à la liaison du calcium. Cela a été utilisé pour contrôler les artefacts de mouvement et d'autres bruits indépendants du calcium. Pour enregistrer simultanément à partir du canal de contrôle (405 nm) et du canal expérimental (465 nm), nous avons utilisé une stratégie « verrouillée » dans laquelle chaque LED était modulée à une fréquence élevée différente (généralement 270 et 500 Hz, respectivement). L'émission résultant des deux modes d'excitation a été enregistrée par le même photodétecteur et le signal a été démodulé en ligne dans Doric Studio pour séparer le canal de contrôle du canal expérimental. Les deux signaux ont ensuite été convertis en dF/F dans le studio Doric à l'aide de leur outil d'analyse, en soustrayant le canal de contrôle du canal expérimental pour réduire le bruit. Le dF/F noté Z a été calculé pour les 5 s avant et 20 s après chaque présentation d'odeur. Les odeurs ont été présentées pendant 2 s suivies d'un intervalle interessai de 18 s. Les cartes thermiques ont été générées dans MATLAB (version R2019a). Les impulsions TTL générées par Arduino ont déclenché l'olfactomètre et ont été utilisées comme entrée numérique pendant l'enregistrement pour aligner précisément l'enregistrement de la photométrie à fibre avec la présentation des odeurs. Une fois que 10 répliques techniques ont été moyennées pour chaque souris individuelle, les répliques biologiques ont été moyennées ensemble pour créer une moyenne composite. La réponse moyenne du score z a été calculée pour 3 s avant (ligne de base) et 3 s après la livraison de l'odeur. Ensuite, les réponses de base moyennes ont été soustraites de la réponse olfactive pour générer une réponse olfactive normalisée de base pour toutes les odeurs. La signification statistique a ensuite été calculée à l'aide d'un test t à un échantillon, comparant les réponses d'odeur normalisées à 0 (l'hypothèse nulle).

Pour les implants optogénétiques, des souris vGlut2-Cre+/− âgées de huit semaines ont reçu une injection stéréotaxique bilatérale dans le BF avec rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (sérotype 2/9), rAAV-Ef1α-flex- GFP (sérotype DJ8) ou rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP (sérotype 2/9). Une semaine plus tard, des souris ont été implantées bilatéralement sur la LHb avec des implants à fibre optique sur mesure, comme décrit dans Patel et Swanson 201967. En bref, un câble à fibre optique de 200 um (0,22 NA, FG200AEA) a été dénudé et fixé dans une virole de 230 um (Thor Labs CFLC2301-10) en utilisant de l'époxy photopolymérisable aux UV (Bondic). L'implant a été coupé à 3,5 mm et l'extrémité plate de l'implant polie pour assurer une sortie lumineuse élevée (au moins 1 mW). L'habenula latérale a été implantée bilatéralement à un angle de 15 degrés aux coordonnées de bregma AP = - 1, 58, ML = ± 0, 34 et DV = - 2, 85. Les implants à fibre optique ont été fixés à l'aide de ciment (ciment C et B Metabond Dental, Parkell) et recouverts d'acrylique flash réticulé (Yates-Motloid 44115 et 44119). Des aiguilles de calibre 18 ont été coupées à environ 1 pouce de longueur et fixées avec de l'acrylique sur la partie postérieure du crâne pour attacher les souris aux câbles de raccordement sans frotter, et à la place en utilisant des pinces à anneau pour attacher les souris aux câbles de raccordement. Les souris ont été autorisées à récupérer pendant deux semaines après la chirurgie d'implantation avant les expériences comportementales.

Les compagnons de litière vGlut2-Cre+/− mâles et femelles ont été injectés stéréotaxiquement avec rAAV-flex-ChR2-EYFP ou rAAV-flex-GFP dans le BF et implantés avec des fibres optiques sur le LHb pour stimuler les terminaux BF. Après 2 semaines de récupération, les souris ont été mises à jeun toute la nuit. Le lendemain, les souris ont été attachées à des câbles de raccordement et autorisées à s'acclimater seules à une chambre de comportement pendant 5 minutes avant de commencer l'expérience. Après acclimatation, des souris individuelles ont été présentées avec de la nourriture et photostimulées avec un laser à 473 nm (Doric; sortie d'au moins 1 mW) à 20 Hz avec des impulsions de 5 ms pendant 5 min. Après 5 min, le laser a été éteint et les aliments ont été pesés. Ensuite, les souris ont été autorisées à consommer de la nourriture sans photostimulation pendant 5 min. Ceci a été répété une fois de plus (5 min avec photostimulation, suivies de 5 min sans photostimulation) pour une durée totale de 20 min, la prise alimentaire étant pesée toutes les 5 min. L'apport alimentaire moyen pour chaque point temporel a été calculé et les groupes témoins ChR2 et GFP ont été comparés via une ANOVA à deux facteurs à mesures répétées.

Pour les souris ArchT-GFP, la même chirurgie stéréotaxique a été réalisée que ci-dessus mais en utilisant rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP. Après récupération, les souris ont été mises à jeun pendant la nuit, attachées à des câbles à fibres optiques, alimentées en nourriture et autorisées à consommer de la nourriture pendant 20 min sans photostimulation pour calculer un apport alimentaire de base (la nourriture a été pesée toutes les 5 min). La semaine suivante, les mêmes souris ont été mises à jeun pendant la nuit, puis photo-inhibées avec un laser de 561 nm (CrystaLaser) à 1 Hz avec des impulsions de 900 ms pendant 20 min en continu tout en étant nourries. Les aliments étaient pesés toutes les 5 minutes. L'apport alimentaire moyen pour chaque point dans le temps a été calculé, et les groupes « aucune stimulation » et « stimulation » ont été comparés via une ANOVA à deux facteurs à mesures répétées.

Les mâles et femelles vGlut2-Cre+/− ont été injectés stéréotaxiquement avec rAAV-flex-ChR2-EYFP, rAAV-flex-GFP ou rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP dans le BF et implantés avec des fibres optiques sur le LHb pour stimuler Bornes BF. Après 2 semaines de récupération, les souris ont été attachées à des câbles de raccordement et placées dans une grande arène rectangulaire (25 pouces x 17 pouces). Les souris ont été laissées s'acclimater pendant 5 min, puis le test a commencé. Les mouvements des animaux ont été suivis à l'aide d'une caméra interfacée avec le logiciel open source Bonsai68, capable de détecter lorsqu'une souris se trouvait dans une ROI prédéterminée. Ce logiciel a ensuite déclenché une impulsion TTL pour la photostimulation laser (lumière de 473 nm, 20 Hz, impulsions de 5 ms pour les souris ChR2 ou lumière de 561 nm, 1 Hz, impulsions de 900 ms pour les souris ArchT) lorsque la souris se trouvait dans cette région. À l'aide de ce logiciel, les souris ont été photostimulées sur une moitié de l'arène tout en se déplaçant librement pendant un total de 20 minutes, tout en étant enregistrées sur vidéo. Pour la préférence de place conditionnée, ce paradigme a été répété pendant 3 jours consécutifs, et le jour du test a été répété sans photostimulation. Pour l'évitement de lieu en temps réel et conditionné, le temps passé dans l'une ou l'autre moitié de l'arène a été calculé post-hoc à l'aide du logiciel open source Optimouse dans MATLAB69. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un test binomial, l'hypothèse nulle étant que les souris passeraient 50 % de leur temps dans les deux moitiés de l'arène. Les cartes thermiques ont été générées à l'aide du logiciel Noldus EthoVision (XT 16).

Le conditionnement contextuel de la peur a été effectué comme décrit précédemment70 avec quelques modifications mineures. Brièvement, les souris ont été manipulées 3 min par jour pendant 3 jours puis habituées à la chambre de conditionnement pendant 20 min pendant deux jours consécutifs. Le jour de la formation, les souris ont été placées dans une chambre avec des marqueurs contextuels visuels sur les parois et acclimatées pendant 2 min (naïves). Les souris ont ensuite reçu 2 chocs au pied à 90 s d'intervalle (0,75 mA, 2 s chacun). Une minute plus tard, les souris ont été renvoyées dans leurs cages d'origine. Deux et 24 h plus tard, les souris ont été replacées dans la chambre de conditionnement pendant 5 min pour tester respectivement la mémoire à court terme et à long terme. Pendant ce temps, la réponse de congélation (immobilité) a été enregistrée à l'aide d'une vidéo en temps réel analysée par FreezeView. La signification statistique a été mesurée à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs à mesures répétées avec une correction de Sidak pour les comparaisons multiples.

Une nouvelle reconnaissance d'objet a été effectuée comme décrit précédemment71 avec des modifications mineures. Les souris ont été habituées à une chambre en plastique noir (37 × 37 × 37 cm) et à des câbles à fibres optiques optogénétiques pendant 10 minutes par jour pendant trois jours avant l'entraînement. Le jour de l'entraînement, les souris ont été attachées à des câbles à fibres optiques et ont été autorisées à explorer deux objets identiques pendant 10 min. Suite à cet entraînement, les objets ont été retirés et les souris ont été photostimulées à 20 Hz (impulsions de 5 ms) pendant 10 min, puis renvoyées dans leur cage d'origine. 24 h plus tard (le jour du test), les souris ont été attachées à des câbles à fibres optiques et présentées avec un objet de la veille (l'objet familier) et un nouvel objet d'environ la même taille (nouvel objet) pendant 10 min. À l'aide du logiciel AnyMaze (version 6.2), la durée d'investigation de l'un ou l'autre objet a été enregistrée par des expérimentateurs formés aveuglés au traitement expérimental. Les souris ont été définies comme enquêtant sur un objet si leur nez reniflait dans un rayon de 2 cm de l'objet. À partir de ces données, un indice de discrimination a été calculé en soustrayant le temps passé à enquêter sur l'objet familier de l'objet nouveau et en divisant par le temps total d'enquête en pourcentage [(temps d'enquête sur un nouvel objet − temps d'enquête sur un objet familier)/(temps d'enquête sur un nouvel objet + objet familier)] × 100. Pour tester la réversibilité de l'effet de photostimulation, le même test a été effectué une semaine plus tard sans photostimulation et avec un ensemble différent d'objets familiers et nouveaux. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs à mesures répétées avec une correction de Bonferroni pour les comparaisons multiples.

Le plasma pour les mesures hormonales a été collecté à trois moments : (1) ligne de base, au cours de laquelle les animaux ont été attachés à des câbles à fibres optiques et autorisés à s'acclimater pendant 2 h pour éliminer le stress lié à la manipulation, puis retirés des câbles et le sang a été immédiatement prélevé. (2) post-stimulation, dans laquelle les animaux ont été attachés à des câbles à fibres optiques, acclimatés pendant 2 h, stimulés pendant 5 min à 20 Hz (impulsions de 5 ms), retirés et le sang immédiatement prélevé, ou (3) 20 min post-stimulation , dans lequel les animaux ont été attachés à des câbles, acclimatés pendant 2 h, stimulés pendant 5 min (impulsions de 20 Hz, 5 ms), laissés au repos pendant 20 min, puis retirés et le sang prélevé. Ces trois points dans le temps ont été séparés par des intervalles de 2 semaines pour éviter les résultats confondants du processus stressant de collecte de sang et pour laisser aux animaux le temps de se remettre de la perte de sang entre les collectes. Le plasma a été recueilli en ponctionnant la veine sous-maxillaire avec une lancette et en recueillant du sang total dans des flacons traités à l'EDTA. Pour les catécholamines (épinéphrine et norépinéphrine), une solution d'EGTA-glutathion a été préparée conformément aux spécifications de base des services analytiques et d'analyse hormonale de l'Université Vanderbilt pour être utilisée comme conservateur. En bref, 4,5 g d'EGTA et 3,0 g de glutathion ont été dissous dans 50 ml de dIH20 ​​(pH de 6,0 à 7,4). La solution d'EGTA-glutathion a été ajoutée aux tubes de catécholamine immédiatement après le prélèvement sanguin à une concentration de 1:50. Le sang a été centrifugé à 14 000 g pendant 15 min à 4 °C pour isoler le plasma. Le plasma a été retiré de la couche supérieure, congelé instantanément et stocké à - 80 ° C jusqu'à ce qu'il soit envoyé au Vanderbilt Hormone and Analytics Core pour analyse hormonale. Les taux d'ACTH et de corticostérone ont été mesurés à l'aide de dosages radio-immunologiques via une procédure à double anticorps, et les catécholamines noréphinéphrine et épinéphrine à l'aide de HPLC via une détection électrochimique. La signification statistique a été mesurée à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs à mesures répétées avec une correction de Sidak pour les comparaisons multiples.

Les compagnons de litière vGlut2-Cre+/− mâles et femelles ont été injectés stéréotaxiquement avec rAAV-flex-ChR2-EYFP ou rAAV-flex-GFP dans le BF et implantés avec des fibres optiques sur le LHb pour stimuler les terminaux BF. Les souris ont été mises à jeun pendant la nuit et placées dans une grande arène rectangulaire (25 pouces x 17 pouces) où elles ont été autorisées à s'acclimater pendant 5 minutes. D'un côté d'une arène, la nourriture était placée en toute sécurité dans un coin, tandis que la nourriture riche en graisses était placée en toute sécurité dans le coin adjacent. Utilisation de l'open source.

Bonsai68, la photostimulation était limitée à un retour sur investissement le long du côté alimentaire de l'arène, juste assez grand pour photostimuler la souris tout en consommant ou en interagissant avec de la nourriture. Les souris ont été enregistrées sur vidéo et la prise de nourriture a été enregistrée pendant un total de 20 min. L'apport alimentaire moyen pour le chow et le chow riche en graisses a été calculé pour les souris ChR2-EYFP et GFP et a été comparé à l'aide d'une ANOVA à deux voies. Le temps passé dans le côté stimulation de l'arène, ainsi que le temps passé à interagir avec l'un ou l'autre choix de nourriture ont été calculés post-hoc à l'aide d'Optimouse dans MATLAB69, et ont été comparés à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Un merci spécial au Dr Joshua Ortiz-Guzman, au Dr Jennifer Selever et au Neurological Research Institute Viral Core (y compris Zihong Chen et Ying Wang) pour la production des AAV utilisés dans ces expériences. De plus, merci aux membres du laboratoire Arenkiel pour leur collaboration et leur aide à la rédaction de ce manuscrit. Le projet décrit a été soutenu par les prix multi-PI du National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (Grant No. R01DK109934) et du US Department of Defense (Grant No. DOD W81XWH-19-1-0429) à BRA et QT, 1R01DK131446 et R01 DK120858 à QT, R01 NS078294 et UF1NS111692 à BRA, et les noyaux de neuroconnectivité et de neurovisualisation du Baylor College of Medicine, qui sont soutenus par le numéro de subvention IDDRC P50 HD103555 du Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development. Le projet décrit a également été en partie soutenu par le Vanderbilt Hormone and Analytics Core soutenu par les subventions NIH DK059637 (MMPC) et DK020593 (DRTC). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l'Institut national de la santé infantile et du développement humain Eunice Kennedy Shriver, des Instituts nationaux de la santé ou du ministère de la Défense. Nous tenons également à remercier le McNair Medical Institute et Charif Souki pour leur soutien continu et généreux à la recherche associée.

Département de génétique moléculaire et humaine, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, États-Unis

Jessica L. Swanson, Joshua Ortiz-Guzman, Snigdha Srivastava, Sean W. Dooling, Elizabeth Hanson Moss, Mikhail Y. Kochukov, Patrick J. Hunt, Brandon T. Pekarek et Benjamin R. Arenkiel

Jan et Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, Houston, Texas, États-Unis

Jessica L. Swanson, Joshua Ortiz-Guzman, Snigdha Srivastava, Elizabeth Hanson Moss, Mikhail Y. Kochukov, Patrick J. Hunt, Jay M. Patel, Brandon T. Pekarek et Benjamin R. Arenkiel

Programme de formation des scientifiques médicaux, Baylor College of Medicine, Houston, TX, États-Unis

Snigdha Srivastava, Patrick J. Hunt et Jay M. Patel

Département de neurosciences, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, États-Unis

Pey-Shyuan Chin, Jay M. Patel et Benjamin R. Arenkiel

Centre des maladies métaboliques et dégénératives, Centre des sciences de la santé de l'Université du Texas à Houston, Houston, TX, États-Unis

Tong de Qingchun

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JLS : conceptualisation, conception expérimentale, conduite d'expériences, collecte de données, analyse de données, rédaction et édition de manuscrits, création de figures. JOG : mentorat et formation pratique, conceptualisation, conception expérimentale, conduite d'expériences. SS : collecte de données, analyse de données, création de figures. PC : collecte de données, analyse de données, création de figures, édition de manuscrits. SWD : mener des expériences, collecter des données, analyser des données. EHM : conduite d'expériences, collecte de données, analyse de données, édition de manuscrits. MYK : mener des expériences, collecter des données, analyser des données. PJH : conduite d'expériences, collecte de données, analyse de données, édition de manuscrits, création de figures. JMP : conceptualisation, mentorat, conception expérimentale, édition de manuscrits. BTP : mentorat, analyse de données, édition de manuscrits. QT : conceptualisation, mentorat, édition de manuscrits. BRA : mentorat, conceptualisation, conception expérimentale, édition de manuscrits.

Correspondance à Benjamin R. Arenkiel.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Swanson, JL, Ortiz-Guzman, J., Srivastava, S. et al. L'activation des circuits basaux du cerveau antérieur vers l'habenula latéral entraîne une aversion réflexive et supprime le comportement alimentaire. Sci Rep 12, 22044 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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Reçu : 24 août 2022

Accepté : 13 décembre 2022

Publié: 21 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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