Caractérisation des résistomes antibiotiques par bactériophage reprogrammé

Nature Microbiology volume 8, pages 410–423 (2023)Citer cet article

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La métagénomique fonctionnelle est un outil expérimental puissant pour identifier les gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) dans l'environnement, mais la gamme d'espèces bactériennes hôtes appropriées est limitée. Cette limitation affecte à la fois la portée des ARG identifiés et l'interprétation de leur pertinence clinique. Nous présentons ici un pipeline de métagénomique fonctionnelle appelé Reprogramd Bacteriophage Particle Assisted Multi-species Functional Metagenomics (DEEPMINE). Cette approche combine et améliore l'utilisation du bactériophage T7 avec des fibres de queue échangées et une mutagenèse ciblée pour étendre la spécificité et l'efficacité de l'hôte phage pour la métagénomique fonctionnelle. Ces particules de phage modifiées ont été utilisées pour introduire de grandes bibliothèques de plasmides métagénomiques dans des pathogènes bactériens cliniquement pertinents. En criblant les ARG dans les microbiomes du sol et de l'intestin et les génomes cliniques contre 13 antibiotiques, nous démontrons que cette approche élargit considérablement la liste des ARG identifiés. De nombreux ARG ont des effets spécifiques à l'espèce sur la résistance; ils fournissent un niveau élevé de résistance chez une espèce bactérienne mais donnent une résistance très limitée chez une espèce apparentée. Enfin, nous avons identifié des ARG mobiles contre des antibiotiques en cours de développement clinique ou récemment approuvés. Dans l'ensemble, DEEPMINE élargit la boîte à outils de métagénomique fonctionnelle pour l'étude des communautés microbiennes.

La métagénomique permet l'analyse exhaustive des communautés microbiennes, y compris les espèces qui ne peuvent pas être cultivées dans des conditions de laboratoire. En extrayant des données génomiques d'échantillons environnementaux, les chercheurs acquièrent des connaissances sur la composition des espèces et la fonctionnalité du microbiome dans une gamme d'environnements naturels1. En particulier, la métagénomique fonctionnelle est consacrée au criblage de l'ADN métagénomique pour la présence de gènes codant pour des fonctions moléculaires spécifiques2,3,4. Le clonage et l'expression d'ADN métagénomique fragmenté dans un hôte bactérien peuvent révéler des protéines précédemment non décrites. Les applications de la métagénomique fonctionnelle comprennent l'identification d'enzymes, l'exploration d'agents bioactifs et le dépistage de gènes de résistance aux antibiotiques résidant dans l'environnement5,6,7,8. Les bibliothèques contiennent généralement des millions de fragments d'ADN, correspondant à une couverture totale de 5 à 100 Go, soit la taille de milliers de génomes bactériens7,9,10.

Bien que la métagénomique fonctionnelle puisse potentiellement être utile dans plusieurs domaines de recherche, dans sa forme actuelle, la méthodologie est loin d'être parfaite, ce qui limite son applicabilité. Compte tenu de la taille énorme des bibliothèques de plasmides, l'introduction efficace de ces bibliothèques dans un hôte bactérien est d'une importance capitale. Cependant, ce processus - généralement par électroporation, conjugaison ou transduction bactériophage conventionnelle - est lourd et n'est efficace que pour une gamme limitée de souches de laboratoire11,12. Cette limitation a des conséquences considérables sur l'applicabilité des écrans métagénomiques fonctionnels et la généralité des conclusions qui peuvent être tirées13,14. Par exemple, il entrave le dépistage des gènes biotechnologiquement ou cliniquement pertinents qui ne sont fonctionnels que chez des espèces bactériennes spécifiques 12,15,16. En particulier, la plupart des écrans métagénomiques pour les gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) reposent fortement sur l'utilisation de souches de laboratoire d'Escherichia coli comme hôtes bactériens5,17,18. Par conséquent, les ARG qui n'offrent pas de résistance dans ces souches mais le font dans d'autres agents pathogènes cliniquement pertinents restent indétectables. En effet, des études antérieures indiquent que l'impact des mutations de résistance aux antibiotiques sur les phénotypes de résistance dépend du fond génétique de l'hôte bactérien19. De plus, les criblages métagénomiques dans plusieurs bactéries hôtes pourraient fournir des informations précieuses sur la compatibilité fonctionnelle interspécifique et la mobilité des ARG20.

Dans cet article, nous présentons la métagénomique fonctionnelle multi-espèces assistée par particules de bactériophage reprogrammée (DEEPMINE), qui apporte une solution à ces problèmes (Fig. 1a). DEEPMINE est basé sur un travail antérieur qui visait à étendre la gamme d'hôtes des particules de phage T7 pour la transduction d'ADN en échangeant les queues entre différents types de bactériophages21. DEEPMINE utilise de telles particules de transduction de bactériophage modifiées pour fournir de grandes bibliothèques de plasmides métagénomiques dans une gamme d'espèces bactériennes. De plus, nous avons appliqué une évolution dirigée en laboratoire pour augmenter l'efficacité de cette livraison de bibliothèque22. En utilisant cette approche, nous avons effectué des criblages métagénomiques chez des pathogènes bactériens cliniquement pertinents de la famille des Enterobacteriaceae. Nous avons identifié plusieurs ARG non signalés auparavant avec des effets spécifiques à l'espèce sur la sensibilité aux antibiotiques. De plus, nous avons étudié un ensemble d'antibiotiques qui n'ont été approuvés que récemment pour une utilisation clinique ou qui sont en phase avancée de développement clinique, et montrons que ces nouveaux antibiotiques sont tout aussi sujets à la formation de résistance que les anciens antibiotiques après des décennies d'utilisation clinique (Extended Data Tableau 1).

a, Aperçu schématique de DEEPMINE. DEEPMINE utilise des particules de transduction de bactériophage T7 hybrides et une évolution dirigée pour modifier la spécificité et l'efficacité du phage hôte pour la métagénomique fonctionnelle dans les souches cliniques cibles. L'ADN environnemental sous forme de bibliothèque de plasmides métagénomiques est ensuite emballé dans ces particules de bactériophage et transduit dans les hôtes d'intérêt. L'analyse comparative des résultats de dépistage est activée par un pipeline de séquençage de fragments d'ADN sans PCR à double code-barres. b, la transduction de la bibliothèque métagénomique fonctionnelle par des particules de bactériophage T7 hybrides spécifiques est au moins aussi efficace que l'électroporation (électroporation dans E. coli vs transduction dans K. pneumoniae P = 0,010545, test t unilatéral à deux échantillons, n = 3 biologiquement indépendant expériences ; électroporation dans E. coli vs transduction dans S. enterica P = 0,15, test t unilatéral à deux échantillons, n = 3 expériences biologiquement indépendantes ; tableau supplémentaire 2). Moyenne ± sem c, d, longueurs (c) et diversités (d) des fragments d'ADN métagénomiques livrés, déterminées à l'aide d'un séquençage profond à lecture longue sans PCR juste après l'électroporation et la transduction (méthodes). Les lignes pointillées représentent la taille moyenne des fragments d'ADN. Les indices de diversité alpha de Shannon (H) ont été calculés sur la base de la fréquence des fragments de séquences identiques dans les bibliothèques (voir Méthodes, n = 276 899, n = 188 317 et n = 180 497 pour E. coli, K. pneumoniae et S. enterica , respectivement ; tableau supplémentaire 3). Veuillez noter que seule une fraction des bibliothèques livrées a été séquencée.

Nous avons d'abord testé si les particules de bactériophage T7 hybrides avec des protéines de queue échangées sont des outils appropriés pour fournir des bibliothèques de plasmides métagénomiques fonctionnels dans des cultures bactériennes. En bref, nous avons créé des bibliothèques métagénomiques pour obtenir des résistomes environnementaux et cliniques23, y compris (1) des échantillons de sédiments fluviaux et de sol provenant de sept sites industriels pollués par des antibiotiques à proximité immédiate d'usines de production d'antibiotiques en Inde (c'est-à-dire un microbiome de sol anthropique)24,25 , (2) des échantillons fécaux de 10 individus européens qui n'avaient pas pris d'antibiotiques depuis au moins 1 an avant le don d'échantillons (c'est-à-dire le microbiome intestinal) et (3) des échantillons d'un pool de 68 bactéries multirésistantes isolées dans des établissements de santé ou obtenu à partir de collections de souches (c'est-à-dire de microbiome clinique ; voir Méthodes, Fig. 1a et Tableau supplémentaire 1).

Des fragments d'ADN d'une taille allant de 1,5 à 5 kb ont été clonés au fusil de chasse dans un plasmide de clonage à faible nombre de copies capable de se répliquer dans des ordres sélectionnés de la classe Gammaproteobacteria26 (voir Méthodes). L'ADN plasmidique porte une séquence signal d'encapsidation qui permet la translocation du plasmide dans le bactériophage T7 indépendamment du génome T7 (Fig. 1a). Chaque bibliothèque construite contenait 3 à 5 millions de fragments d'ADN, correspondant à une couverture totale de 25 Gb (c'est-à-dire la taille d'environ 5 000 génomes bactériens). Les bibliothèques de plasmides résultantes ont été conditionnées dans deux particules de phage T7 hybrides précédemment caractérisées qui affichent des protéines de fibre de queue du phage Salmonella ΦSG-JL2 et du phage Klebsiella K1121. Les trois bibliothèques métagénomiques ont été transduites dans Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium str. LT2 et K. pneumoniae NCTC 9131, qui sont tous deux des cibles bactériennes connues de ces deux particules de bactériophage T7 hybrides21. En parallèle, nous avons électroporé les bibliothèques dans la bactérie modèle E. coli K12 (Méthodes). Enfin, nous avons analysé si la transduction par des particules de phage T7 introduit un biais dans la taille et la composition des bibliothèques (Méthodes).

De manière frappante, les particules de bactériophage T7 hybrides affichant la queue ΦSG-JL2 et K11 ont livré les bibliothèques de plasmides dans sa souche bactérienne ciblée au moins aussi efficacement que l'électroporation dans la souche modèle de laboratoire E. coli (Fig. 1b et Tableau supplémentaire 2). En particulier, le nombre maximal de plasmides délivrés aux bactéries hôtes était d'au moins deux ordres de grandeur plus élevé par transduction que par électroporation (données étendues Fig. 1a et tableau supplémentaire 2).

De plus, le séquençage en profondeur à lecture longue montre que la taille moyenne des fragments d'ADN et la diversité des fragments des bibliothèques délivrées par les particules de phage T7 sont comparables à celles de la bibliothèque délivrée par électroporation dans E. coli (Fig. 1c, d et Tableau supplémentaire 3). Cela indique que la transduction par des particules de bactériophage reprogrammées n'a pas d'effet de distorsion sérieux sur la taille et la diversité des bibliothèques métagénomiques délivrées. Enfin, nous avons séquencé le contenu plasmidique de 38 clones bactériens individuels isolés après transduction de phage. De manière rassurante, la co-transduction de deux plasmides dans la même cellule, un phénomène qui se traduit par des faux positifs d'auto-stoppeurs lors d'une campagne de dépistage, n'a été détectée que dans 5 % des cellules, tandis que la co-transformation de deux plasmides dans la même cellule par électroporation s'est produit dans 10% des cellules (Extended Data Fig. 1b). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que certaines particules de bactériophage transductrices T7 avec des fibres de queue échangées sont des véhicules de livraison appropriés pour la métagénomique fonctionnelle.

Notre prochain objectif était de généraliser notre approche pour l'implication d'espèces pathogènes bactériennes supplémentaires. Les efficacités de transduction de la plupart des particules de phages hybrides sont bien inférieures au seuil (> 107 transductants par ml) requis pour la livraison de bibliothèques métagénomiques fonctionnelles entières dans les cellules bactériennes cibles21. De plus, la livraison de telles bibliothèques nécessite l'utilisation de concentrations élevées des particules de phage transducteur. Dans de tels cas, la contamination par des phages réplicatifs, un problème courant de transduction de la génération de particules de bactériophage27, tue une grande partie des cellules cibles (Extended Data Fig. 1c).

Pour surmonter ces deux problèmes, nous avons mis en place une expérience d'évolution dirigée pour modifier génétiquement les régions de fibres de queue dans les particules de phage T7. Plus précisément, nous avons cherché à sélectionner des mutations ponctuelles dans les régions déterminant la gamme d'hôtes (HRDR) des fibres de queue de phage qui modifient la spécificité de l'hôte28,29. À cette fin, nous avons d'abord sélectionné trois fibres de queue (Escherichia phage T7, Salmonella phage ΦSG-JL2 et Salmonella phage Vi06) avec des gammes d'hôtes particulièrement larges21. Ensuite, nous avons identifié des HRDR potentiels dans le gène de la fibre de queue gp17 du phage Salmonella ΦSG-JL2 et vi06_43 du phage Salmonella Vi06. L'identification était basée sur l'homologie de séquence avec quatre HRDR dans le domaine de liaison au récepteur (RBD) du gène de fibre de queue de phage T7 et T3 bien caractérisé gp17 (Méthodes et tableau supplémentaire 4)28,29. Ensuite, nous avons introduit des mutations distribuées de manière aléatoire à l'intérieur et à proximité des HRDR des gènes de la fibre de queue dérivés des phages ΦSG-JL2, Vi06 et T7 en utilisant une méthode de mutagenèse dirigée à haute fréquence appelée DIvERGE (Fig. 2a et Méthodes)22. Par rapport à d'autres protocoles de mutagenèse, DIvERGE présente l'avantage d'introduire simultanément des mutations aléatoires le long de plusieurs sites d'ADN et peut couvrir des segments d'ADN relativement longs, potentiellement au-delà des HRDR prédits22.

a, aperçu schématique de l'expérience d'évolution dirigée comprenant les étapes suivantes. (1) Mutagenèse de queue de phage dans E. coli en utilisant DIvERGE. DIvERGE est une technique de recombinaison qui incorpore des oligonucléotides d'ADN simple brin (ss) randomisés dans plusieurs sites cibles (Méthodes). Les queues de phage sont codées sur des plasmides empaquetables. (2) Infecter E. coli avec T7 dépourvu des gènes de queue (T7Δ(gp11-12-17)). Cette étape génère des particules de phage mutés, chacune contenant le plasmide codant pour la queue de phage mutant apparenté. (3) Sélection de variants de queue de phage qui injectent de l'ADN dans les cellules cibles sélectionnées (1–3) avec une efficacité améliorée. La pression de sélection est exercée par un antibiotique contre lequel un marqueur de sélection antibiotique est codé sur le plasmide. b, efficacités de transduction (tfu ml-1) des fibres de queue mutantes les plus efficaces par rapport aux queues WT parentales. Les cellules cibles sont Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 et E. coli NCTC 13351 ainsi que la souche modèle E. coli résistante aux phages (BW25113ΔtrxAΔwaaR). Moyenne ± sem (n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 4.

En utilisant un protocole d'optimisation de la transduction21, nous avons ensuite sélectionné des variants de queue de phage avec une capacité améliorée à fournir des bibliothèques de plasmides à des représentants de trois espèces bactériennes pathogènes : Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 et E. coli NCTC 13351 (Méthodes, Fig. 2b et Tableau supplémentaire 4). Simultanément, en tant que contrôle positif, nous avons sélectionné la bibliothèque de queue de phage T7 avec le même protocole en présence d'une souche modèle d'E.

À la suite de l'évolution dirigée, l'efficacité de la transduction de l'ADN a été améliorée de un à sept ordres de grandeur dans les trois souches bactériennes pathogènes testées (Fig. 2b). Avec Shigella sonnei HNCMB 25021, l'efficacité de transduction a atteint le niveau approprié pour la livraison de bibliothèques entières de plasmides métagénomiques (Fig. 2b). Dans le cas de la souche modèle témoin positif ΔwaaR, les HRDR mutants T7 gp17 les plus efficaces portent des combinaisons spécifiques de mutations, dont 28% ont déjà été décrites comme des mutations adaptatives (Extended Data Fig. 2a – c). Dans l'ensemble, les mutations adaptatives ont augmenté l'efficacité de transduction (Fig. 2b, Données étendues Fig. 2d et Tableau supplémentaire 4), et au moins dans un cas (T7 gp17V544G (Mut1 sur Fig. 2b) avec Shigella sonnei HNCMB 25021), elles ont également minimisé contamination de phage réplicatif (pour une explication, voir Données étendues Fig. 3 et Tableau supplémentaire 5). De manière rassurante, la transduction des trois bibliothèques métagénomiques dans Shigella sonnei HNCMB 25021 par ce variant de queue de phage T7 a abouti à des bibliothèques métagénomiques fonctionnelles aussi grandes et diverses que la bibliothèque obtenue par électroporation dans la souche E. coli K12 (Extended Data Fig. 4 et tableaux supplémentaires 2 et 3). Dans l'ensemble, nous avons constaté que l'évolution dirigée de la queue du phage améliore la livraison de bibliothèques métagénomiques dans des souches bactériennes précédemment inexploitées par rapport à la livraison des mêmes bibliothèques par électroporation.

Notre prochain objectif était d'améliorer l'échantillonnage du résistome antibiotique bactérien grâce à la métagénomique fonctionnelle chez plusieurs hôtes bactériens. À cette fin, nous avons criblé les trois bibliothèques métagénomiques décrites ci-dessus (sol, intestin, clinique) dans trois hôtes bactériens pathogènes (Salmonella enterica LT2, K. pneumoniae NCTC 9131 et Shigella sonnei HNCMB 25021) et dans E. coli BW25113. Les criblages ont été effectués sur gélose solide en présence de l'un des 13 antibiotiques sélectionnés couvrant cinq grandes classes d'antibiotiques (tableau de données étendu 1) à des concentrations auxquelles les souches hôtes de type sauvage (WT) sont sensibles. La liste comprend six antibiotiques (doxycycline (DOX), gentamicine (GEN), cefdinir (CFD), céfoxitine (CEF), méropénem (MER) et moxifloxacine (MOX)) avec une longue histoire clinique (« ancien »), et sept autres ( eravacycline (ERA), omadacycline (OMA), sulfate d'apramycine (APS), ceftobiprole (CEF), sulopenem (SUL), délafloxacine (DEL) et gépotidacine (GEP)) qui ont été récemment introduits dans la clinique (après 2017) ou sont actuellement en développement clinique ("récent", en date d'avril 2020, tableau de données étendu 1). Tous les antibiotiques étudiés, y compris CEF32, ont démontré une activité contre les pathogènes à Gram négatif. Il convient de noter que l'APS est utilisé en médecine vétérinaire depuis plus d'une décennie, mais qu'il fait actuellement l'objet d'essais cliniques pour traiter les infections systémiques à Gram négatif chez l'homme33.

Les plasmides conférant la résistance obtenus ont été regroupés et séquencés avec un pipeline de séquençage de bibliothèque d'expression à double code-barres modifié (données étendues Fig. 5 et méthodes; voir également réf. 34). Le protocole évite l'amplification par PCR des fragments d'ADN conférant de la résistance, préservant ainsi la composition originale des échantillons. En alignant les séquences d'ADN obtenues sur les gènes de résistance aux antibiotiques dans les bases de données pertinentes35,36, nous avons constaté que 84% des 571 fragments présentaient une similitude de séquence suffisante (méthodes) avec les gènes de résistance connus (tableau supplémentaire 6). Comme de nombreux ARG détectés ont été isolés sur plusieurs fragments d'ADN différents, les ARG ont été regroupés à 95 % d'identité et de couverture pour réduire la redondance des séquences dans l'ensemble de données37. Pour quantifier la reproductibilité du pipeline, nous avons répété le protocole complet (livraison d'une bibliothèque, dépistage et séquençage) avec K. pneumoniae. De manière rassurante, 83, 3% des ARG ont été isolés dans les deux réplicats biologiques (Fig. 3a).

a, Reproductibilité du pipeline. Le diagramme de Venn montre le nombre d'ARG détectés dans deux écrans biologiques répliqués avec K. pneumoniae. L'intersection représente les ARG isolés dans les deux répétitions, correspondant à une reproductibilité de 83 % (tableau supplémentaire 6). b, diagramme de Venn montrant le nombre d'ARG isolés utilisant E. coli et le reste de l'espèce hôte. Lorsque E. coli a été utilisé comme seul hôte, 43% des 114 ARG au total sont restés non détectés (tableau supplémentaire 6). c, carte thermique montrant les familles de gènes des ARG identifiées à l'aide des quatre espèces hôtes. Le code couleur quantifie le nombre d'ARG identifiés appartenant à la famille de gènes (tableau supplémentaire 7). d, nombre d'ARG identifiés dans les quatre hôtes sur les trois résistomes utilisés (tableau supplémentaire 6). e, Nombre d'ARG mobiles (représentés par HGT pour indiquer la détection de l'implication dans le transfert horizontal de gènes) et non mobiles (représentés comme non-HGT pour indiquer l'absence d'implication dans le transfert horizontal de gènes) présents sur des contigs multiples et uniques dans le bibliothèques métagénomiques (test exact de Fisher bilatéral, P = 1, 058 × 10−5, n = 114; tableau supplémentaire 6).

Au total, 114 ARG ont été détectés, dont beaucoup étaient présents dans plusieurs fragments d'ADN (tableaux supplémentaires 6 et 7). L'analyse a également révélé des différences substantielles dans les répertoires ARG identifiés entre les quatre espèces bactériennes hôtes examinées. En particulier, lorsque l'analyse a été limitée à E. coli en tant qu'hôte bactérien, 43% des 114 ARG au total sont restés non détectés (Fig. 3b – d et Extended Data Fig. 6). Cela indique que DEEPMINE permet un échantillonnage plus complet des résistomes bactériens par l'utilisation de plusieurs bactéries hôtes. Les pompes à efflux, leurs régulateurs transcriptionnels correspondants et les enzymes inactivant les antibiotiques étaient courants parmi les ARG détectés (Fig. 3c et Extended Data Fig. 7a). Une fraction substantielle des ARG isolés de l'intestin, du sol et des microbiomes cliniques provenait de Proteobacteria, qui sont phylogénétiquement proches parents des espèces bactériennes hôtes dans nos cribles (Extended Data Fig. 7b).

Ensuite, nous avons déterminé si les ARG détectés dans notre écran sont sujets au transfert horizontal de gènes dans la nature. Les ARG qui ont été mobilisés dans le passé dans des environnements associés à l'homme peuvent présenter un risque sanitaire plus élevé car ils ont le potentiel de se répandre parmi les agents pathogènes humains38. Pour étudier cette question, nous avons généré un catalogue de gènes mobiles sur la base de l'identification de gènes presque identiques qui sont partagés par des génomes bactériens éloignés37,39,40. Plus précisément, nous avons effectué l'alignement par paires de 2 794 génomes d'espèces bactériennes liées à l'homme phylogénétiquement diverses (tableau supplémentaire 8). Cet ensemble de données a été étendu avec une base de données de séquences de 27 939 plasmides naturels dérivés de divers environnements (réf. 41, Methods). Les ARG portés par des plasmides étaient particulièrement susceptibles d'être transférés entre espèces bactériennes, avec un accord de 91% entre les deux ensembles de données sur les ARG mobiles (tableau supplémentaire 7). Remarquablement, les ARG présents dans plusieurs fragments d'ADN dans notre crible ont été plus fréquemment soumis à un transfert de gène horizontal par rapport aux ARG qui ne sont présents que dans un seul fragment d'ADN (Fig. 3e).

Ensuite, nous avons demandé comment la variation des répertoires ARG détectés à travers les quatre hôtes bactériens peut être expliquée. La première hypothèse était que certains ARG restent non détectés en raison de la perte stochastique de plasmide. Cela peut se produire lors de la transduction de la bibliothèque métagénomique dans leurs nouveaux hôtes ou pendant le processus de criblage. Alternativement, les ARG transférés peuvent ne pas être fonctionnellement compatibles avec la physiologie de tous les hôtes bactériens20. Par conséquent, plusieurs ARG n'offrent une résistance que chez des espèces bactériennes spécifiques. Bien que la première hypothèse soit certainement pertinente, plusieurs sources de données indiquent des différences substantielles dans le phénotype de résistance des ARG entre les espèces bactériennes.

Pour tester ces hypothèses, nous avons d'abord examiné comment les fragments d'ADN qui confèrent une résistance aux antibiotiques chez E. coli façonnent la sensibilité aux antibiotiques chez les trois autres espèces bactériennes hôtes. Nous avons analysé un ensemble représentatif de 13 fragments d'ADN conférant une résistance dérivés de nos cribles en mesurant les niveaux de résistance aux antibiotiques qu'ils fournissent à travers les hôtes bactériens. Comme certains ARG ont été détectés dans plusieurs dépistages d'antibiotiques, nous avons étudié 20 combinaisons antibiotiques-fragments d'ADN au total (Fig. 4a). Dans sept des 20 cas étudiés, le fragment d'ADN n'a fourni aucun changement dans le niveau de résistance d'au moins une des trois autres espèces bactériennes (en utilisant un double changement des concentrations minimales inhibitrices (MIC) comme seuil). Par conséquent, en moyenne, seulement 80 % des ARG fonctionnels se chevauchaient entre les paires d'E. coli et les trois autres espèces. De plus, nous avons observé une variation substantielle, jusqu'à 256 fois, du niveau de résistance fourni par les fragments d'ADN spécifiques (Fig. 4a et Tableau supplémentaire 9). Les pompes à efflux, les protéines régulatrices de la transcription et les enzymes modifiant les antibiotiques ont présenté une variation aussi importante des niveaux de résistance entre les espèces bactériennes étudiées (Fig. 4a).

a, carte thermique montrant une variation substantielle des niveaux de résistance fournis par les 13 fragments d'ADN conférant de la résistance chez les quatre espèces hôtes. Le code couleur quantifie les changements de pli MIC. La couleur blanche signifie qu'il n'y a pas de changement dans le niveau de résistance, en utilisant un double changement du MIC comme seuil. Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 9. b, Coefficients de similarité Jaccard ajustés qui représentent les chevauchements des ensembles ARG fonctionnels entre les paires d'espèces hôtes après contrôle du bruit de mesure (voir Méthodes et données étendues Fig. 8). Les nombres entre parenthèses représentent les intervalles de confiance à 95 % (Méthodes).

Enfin, nous avons réexaminé tous les fragments d'ADN conférant une résistance détectés dans les cribles métagénomiques. Nous avons regroupé les plasmides correspondants et réintroduit la bibliothèque de plasmides présélectionnée résultante dans chacune des quatre espèces hôtes bactériennes natives. Nous avons ensuite effectué de nouveaux cribles de sélection d'antibiotiques avec cette banque sur gélose solide, comme décrit précédemment. Pour contrôler la perte de plasmide stochastique pendant la transduction, nous avons séquencé la nouvelle bibliothèque de plasmides avant et après la sélection antibiotique. Parmi les ARG, 70% (80 sur 114) étaient représentés par au moins un plasmide dans les quatre espèces hôtes bactériennes après la transduction, mais avant la sélection antibiotique (tableau supplémentaire 10). Après sélection antibiotique, 63 de ces ARG ont été détectés pour montrer une activité antibactérienne chez au moins une des quatre espèces hôtes bactériennes (tableau supplémentaire 10). Notamment, 16 des 17 ARG perdus lors de la sélection des antibiotiques n'étaient codés que par un seul fragment d'ADN conférant une résistance (Extended Data Fig. 8a). Après avoir ajusté les chevauchements avec la précision de l'écran (Extended Data Fig. 8b), en moyenne, 70% des ARG se chevauchaient entre les paires d'espèces (Fig. 4b et Extended Data Fig. 8c). Au total, seulement ~ 46% des ARG (~ 29 sur 63) ont fourni une résistance chez les quatre espèces hôtes bactériennes (Extended Data Fig. 8d). De toute évidence, les travaux futurs sur de plus grands ensembles de données métagénomiques devraient révéler les caractéristiques biochimiques, cellulaires et phylogénétiques exactes qui façonnent les profils de spécificité d'espèce des ARG.

Ensemble, ces résultats indiquent que les ARG, lorsqu'ils sont transférés à de nouveaux hôtes bactériens, ont fréquemment des effets spécifiques à l'espèce sur la sensibilité aux antibiotiques.

Ensuite, nous avons estimé la prédisposition des antibiotiques «récents» à la mobilisation ARG par rapport aux antibiotiques «anciens». Nous avons constaté que le nombre total d'ARG est statistiquement le même pour les deux groupes d'antibiotiques (Fig. 5a, Tableau 1), quels que soient les microbiomes pris en compte (Extended Data Fig. 9a). De plus, lorsque l'analyse a été limitée aux ARG avec des événements de transfert de gène horizontal établis, les résultats ci-dessus sont restés (Fig. 5b et Extended Data Fig. 9b). Comme prévu, les mécanismes de résistance se chevauchent largement entre les antibiotiques «anciens» et «récents» appartenant aux mêmes classes de médicaments (Fig. 5c), ce qui suggère que la résistance croisée pourrait être répandue. CEF, une céphalosporine de cinquième génération qui a récemment été approuvée pour le traitement de la pneumonie nosocomiale et communautaire42,43 met en évidence ce point. La fréquence globale des ARG (par exemple, les β-lactamases) et la fréquence des ARG mobiles étaient exceptionnellement élevées contre le CEF (tableau 1), même par rapport à celles des «anciens» antibiotiques β-lactamines avec des décennies d'utilisation clinique (Fig. 5a–c). En effet, les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) hydrolysent généralement le ceftobiprole44, d'où son utilité clinique contre les pathogènes Gram-négatifs multirésistants produisant de telles BLSE est limitée45.

a, Le nombre total d'ARG est statistiquement le même pour les antibiotiques « récents » et « anciens » (test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon, P = 0,8051, n = 107 pour « ancien » et n = 114 pour « récent » ; Tableau supplémentaire 7). b, Il en va de même pour les ARG avec des événements de transfert de gène horizontal établis (P = 0, 6106, test de somme de rang de Wilcoxon bilatéral, n = 27 et 23 pour les antibiotiques «anciens» et «récents», respectivement; Tableau supplémentaire 7). c, Les mécanismes de résistance se chevauchent largement entre les antibiotiques « anciens » et « récents » appartenant aux mêmes classes de médicaments. La carte thermique montre le regroupement des antibiotiques sur la base des profils ARG. Le codage couleur quantifie le nombre d'ARG détectés qui sont regroupés par mécanisme. Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 7.

Une exception notable à cette tendance est l'APS, un antibiotique en essai clinique pour une application chez l'homme. Un seul ARG a été détecté contre cet antibiotique dans le résistome intestinal et aucun dans la collection regroupée d'isolats cliniques (tableau supplémentaire 7). Cependant, en accord avec l'utilisation intensive de l'APS en médecine vétérinaire pendant des décennies, plusieurs ARG contre l'APS ont été détectés dans le microbiome du sol (Fig. 5c). Les ARG identifiés sont principalement des aminosides acétyltransférases qui sont fonctionnellement compatibles chez plusieurs hôtes pathogènes (tableau 1, tableau supplémentaire 7 et figure 5c). Cela suggère que ces gènes peuvent présenter un risque clinique potentiel à l'avenir. Conformément à cette attente, l'une de ces aminosides acétyltransférases, l'AAC(3)-IV, a déjà été détectée dans des bactéries cliniques résistantes à l'APS46. Dans l'ensemble, DEEPMINE pourrait être un outil utile pour prédire les ARG actuellement détectables uniquement dans les microbiomes non associés à l'homme avec des implications potentielles pour la santé.

Dans ce travail, nous introduisons DEEPMINE, une approche qui élargit la gamme d'espèces bactériennes hôtes applicables en métagénomique fonctionnelle. Des travaux antérieurs ont montré que la gamme d'hôtes du bactériophage peut être élargie en échangeant la fibre de queue du phage T7 d'E. coli ou en générant des mutations aléatoires dans les gènes codant pour la fibre de queue T721. DEEPMINE utilise de telles particules de transduction de bactériophage reprogrammées avec des fibres de queue échangées et/ou mutagénisées pour fournir de grandes bibliothèques de plasmides métagénomiques dans une gamme d'espèces bactériennes (Fig. 1). Le principal avantage de DEEPMINE par rapport aux techniques existantes de métagénomique fonctionnelle, telles que l'électroporation ou la conjugaison, est sa plus grande efficacité. En particulier, nous avons constaté que DEEPMINE est plus adapté à l'introduction de bibliothèques de plasmides métagénomiques à petit insert (1,5 kb à 5 kb) dans les hôtes bactériens sélectionnés que l'électroporation (Fig. 1 et Extended Data Fig. 1) 4,47. Alors que la conjugaison est fréquemment utilisée pour fournir des bibliothèques avec de grandes tailles d'inserts (10 kb à 40 kb) qui contiennent généralement 104 à 105 clones, il est très difficile d'obtenir plus de 106 à 107 transconjugants avec cette technique48,49. D'autre part, une bibliothèque métagénomique à petit insert (1,5 kb à 5 kb) telle qu'utilisée dans cette étude nécessite généralement plus de 108 plasmides pour fournir des bibliothèques avec une couverture suffisante.

En utilisant notre approche, nous avons effectué 156 cribles métagénomiques avec toutes les combinaisons possibles de 13 antibiotiques, trois bibliothèques métagénomiques (isolées du sol, des intestins et des microbiomes cliniques) et quatre espèces d'entérobactéries apparentées. Nous démontrons qu'en étudiant plusieurs espèces d'hôtes, le résistome bactérien est considérablement élargi ; 43% des ARG non chevauchants restent non détectés lorsqu'une seule espèce (E. coli) a été considérée (Fig. 3). En conséquence, DEEPMINE permet l'identification des ARG qui fournissent une résistance uniquement à des agents pathogènes spécifiques cliniquement pertinents. En effet, nous avons identifié un large ensemble d'ARG contre des antibiotiques récemment développés et susceptibles de devenir de futurs risques pour la santé (Fig. 5). Sur la base de ces résultats, nous prévoyons que DEEPMINE sera un outil utile pour prédire la diffusion future des ARG pour lesquels il existe un intérêt général croissant6,16,37,38,50. Cependant, la limitation actuelle de DEEPMINE est qu'il faut beaucoup de temps et de ressources pour concevoir des particules de phage appropriées pour permettre aux bactéries hôtes d'intérêt d'être utilisées pour la métagénomique fonctionnelle.

En résumé, notre travail fournit un aperçu plus approfondi des forces qui façonnent le résistome mobile. Les travaux futurs devraient élargir les bibliothèques métagénomiques impliquées pour classer la mobilité et la compatibilité fonctionnelle des ARG détectés de manière plus complète et tester dans une gamme plus large d'isolats cliniques.

Cette recherche est conforme à toutes les réglementations éthiques pertinentes approuvées par le Human Investigation Review Board du Albert Szent-Györgyi Clinical Center de l'Université de Szeged et la National Biodiversity Authority (NBA) de l'Inde. L'autorisation pour la collecte d'échantillons fécaux a été obtenue auprès du Human Investigation Review Board du Centre clinique Albert Szent-Györgyi, Université de Szeged (enregistré sous 72/2019-SZTE). Les participants volontaires ont été sélectionnés sur la base de critères stricts selon lesquels (1) ils n'ont pas pris d'antibiotiques pendant au moins un an avant le don de l'échantillon et (2) ils sont en bonne santé. Ces exigences sont standard dans le domaine et garantissent une comparaison sans biais des résistomes antibiotiques dans le microbiome intestinal humain sain. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants. La collecte d'échantillons de sols et de sédiments fluviaux dans les environs de la ville d'Hyderabad et de Lucknow a été approuvée par la National Biodiversity Authority (NBA), Inde (numéro de demande : NBA/Tech Appl/9/1822/17/18-19/3535). Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, mais nos tailles d'échantillon sont similaires à celles rapportées dans les publications précédentes18,51,52. Les échantillons n'ont pas été attribués aux groupes expérimentaux. Les échantillons pour chaque expérience individuelle ont été manipulés par une personne responsable. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées en aveugle aux conditions des expériences. Aucune donnée n'a été exclue de l'analyse. Sauf indication contraire, lors de l'utilisation d'un kit, nous avons suivi les instructions du fabricant.

Un plasmide personnalisé a été créé à partir du vecteur d'expression pZE21 (tableau supplémentaire 11) pour la compatibilité avec la transduction T7 et les pipelines de séquençage. Plus précisément, l'origine de réplication est passée de ColE1 à p15A et le signal d'encapsidation du bactériophage T7 a été introduit (les enzymes et les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 11). Par la suite, le vecteur pZE21_p15A a été amplifié par PCR à l'aide d'un mélange d'amorces contenant des codes-barres aléatoires de 10 nt de long (tableau supplémentaire 11), suivi d'une digestion et d'une auto-ligature.

Pour la bibliothèque du microbiome intestinal, nous avons collecté des échantillons fécaux de 10 individus en bonne santé, non apparentés, sans antécédents de prise d'antibiotiques au cours de l'année précédant le don d'échantillons. Pour le microbiome anthropique du sol, des échantillons ont été prélevés dans des zones industrielles fortement contaminées par des antibiotiques en Inde53. L'ADN métagénomique des échantillons d'intestin et de sol a été extrait à l'aide du kit DNeasy PowerSoil (Qiagen, 47016). L'ADN génomique d'isolats bactériens cliniques (tableau supplémentaire 1) a été isolé à l'aide du kit d'ADN génomique bactérien Sigma GenElute (Sigma, NA2110-1KT).

De chaque échantillon, 40 µg d'ADN extrait ont été digérés avec l'enzyme MluCI (NEB, R0538L) (10 min, 37 °C), puis inactivés (20 min, 85 °C). La quantité d'enzyme MluCI a été modifiée pour obtenir de l'ADN dans la plage de taille cible de 1 à 5 kpb. L'ADN a été isolé par électrophorèse sur gel en champ pulsé (Sage Science, PB02901) avec une cassette de gel d'agarose à 0, 75% et une définition de cassette de marqueur S1 à basse tension de 1 à 6 kpb. Les fragments d'ADN métagénomique ont été ligaturés dans le plasmide pZE21_p15A au site EcoRI en utilisant un rapport de masse de 3:1 insert:vecteur. Le mélange de ligature pur a été électroporé dans 40 µl de cellules E. coli MegaX (Invitrogen, C640003) ou E. coli 10G ELITE (Lucigen, 60080-2). Après une heure d'incubation à 37 ° C, les transformants ont été étalés sur des plaques de gélose Luria Bertani (LB) contenant 50 µg ml-1 de kanamycine dans des dilutions 101 ×, 102 × et 103 × pour la détermination des unités formant colonies. Le reste des cellules récupérées a été cultivé pendant une nuit sur des plaques de gélose LB additionnées de kanamycine. Le lendemain, les plasmides ont été isolés. La distribution de la taille des inserts a été estimée par amplification PCR des régions plasmidiques pertinentes de 10 à 20 clones sélectionnés au hasard. La taille moyenne de l'insert a été déterminée comme étant de 2 à 3 kbp.

La préparation de bactériophages hybrides transducteurs a été adaptée de la réf. 21. En bref, des cellules E. coli BW25113 contenant des plasmides codant pour la queue de phage (tableau supplémentaire 11) ont été cultivées jusqu'à une densité optique (DO) de 600 nm ~ 0, 7 (250 tr/min à 37 ° C), puis placées sur de la glace pendant 15 min. Ensuite, les cultures ont été centrifugées (2 200 × g, 4 ° C, 10 min), le surnageant a été jeté et les cellules remises en suspension dans la même quantité de milieu (LB ou Terrific Broth (TB)). Ensuite, des bactériophages T7 dépourvus de régions codant pour les fibres T7 (T7∆(gp11-12-17)) ont été utilisés pour infecter des cellules à une multiplicité d'infection (MOI) 2–3. Après 2 h d'incubation (100 tr/min, 37 °C), les cellules ont été traitées avec du chloroforme à 2 % et vortexées. Le mélange a ensuite été centrifugé avec les mêmes paramètres que ci-dessus. Enfin, le surnageant contenant les particules de phage a été récupéré.

Les efficacités de transduction ont été mesurées comme décrit précédemment21. En bref, les cellules bactériennes cibles ont été cultivées jusqu'à OD600 ~ 0, 5 (250 tr / min à 37 ° C), suivies d'une incubation de 15 minutes sur de la glace, au cours de laquelle des dilutions des particules de phage transducteur ont été préparées avec des étapes de dilution décuplées. Ensuite, 50 ul de cellules cibles ont été mélangés avec 50 ul de particules de phage de chaque dilution. Les plaques ont été incubées à 37°C à 180 rpm pendant 1 h. Les échantillons ont ensuite été déposés sur des plaques de gélose contenant des antibiotiques. Les unités de formation de transductant par ml (tfu ml-1) ont été calculées sur la base du nombre de colonies.

La souche E. coli K12 BW25113 contenant des plasmides codant pour la queue de phage a été électroporée avec 30 ng de chaque bibliothèque de plasmides en cinq parallèles pour obtenir un nombre de colonies approprié, puis étalée sur des plaques de gélose LB contenant un antibiotique et cultivée pendant la nuit. Après croissance, les cellules ont été stockées dans du glycérol à 20 % à -80 °C. Ensuite, les cellules congelées contenant la bibliothèque ont été cultivées dans 40 ml de LB additionné de kanamycine 50 et de streptomycine 100 en secouant à 230 tr/min à 37 ° C jusqu'à OD600 0,7. Les cellules ont été refroidies sur de la glace, centrifugées à 2 000 × g (4 ° C, 10 min) et remises en suspension dans du milieu LB. Ensuite, le bactériophage T7∆(gp11-12-17) a été utilisé pour infecter les cellules à MOI 2–3. Après 2 h d'incubation (100 tr/min à 37 °C), les cellules ont été traitées avec du chloroforme à 2 % et vortexées. Le mélange a ensuite été centrifugé et le surnageant a été récupéré.

Des cultures d'une nuit des souches bactériennes correspondantes ont été diluées à DO6oo 0,1 dans 50 ml de milieu LB pour croître à 230 tr/min à 37 °C jusqu'à DO6oo 0,5. Ensuite, nous avons ajouté 20 ml de bibliothèque contenant des particules de transduction aux cellules, suivies d'une incubation d'une heure aux mêmes paramètres. Ensuite, les cellules ont été centrifugées à 2 200 × g pendant 10 min à 4 ° C, remises en suspension dans 1 à 5 ml de milieu LB, étalées sur LB + kanamycine 50 et cultivées pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été collectées et conservées avec du glycérol à -80 °C. De chaque bibliothèque, 50 ng ont été électroporés dans E. coli K12 BW25113 en cinq parallèles. Les cellules ont été récupérées dans du milieu SOC pendant une heure à 37 ° C et étalées sur des plaques LB + kanamycine 50 et cultivées pendant la nuit. Le lendemain, les cellules ont été collectées et stockées dans du glycérol à 20 % à -80 °C.

Pour localiser les HRDR des gènes de la fibre de queue, nous avons utilisé l'alignement de séquences par paires, où les HRDR récemment identifiés de gp17 du coliphage T329 ont été alignés sur les séquences de fibres de queue du phage Escherichia T7 gp17, du phage Salmonella ΦSG-JL2 gp17 et du phage Salmonella Vi06 gp43. . Les sites déterminés et les régions proximales ont ensuite été soumis à une mutagenèse ciblée par DIvERGE22, une technique basée sur l'incorporation ciblée d'oligos 90-mer porteurs de charge mutationnelle. En bref, des cellules E. coli BW25113 portant le plasmide codant pour la queue de phage à muter et le plasmide médiant la mutagenèse22 ont été cultivées à ~ DO600 0,3–0,4 dans TB (250 tr/min à 37 °C) alimentées avec les antibiotiques appropriés. Ensuite, de l'acide m-toluique a été ajouté (concentration finale de 1 mM) pour induire l'expression du gène et après une incubation d'une heure, les cellules ont été transférées dans de la glace pendant 15 minutes. La culture cellulaire a été rendue électrocompétente par des lavages et centrifugations répétés (2 200 × g, 4 ° C, 10 min, trois fois), puis électroporée avec des oligos 2, 5 µM (tableau supplémentaire 11). Après récupération dans TB (250 tr/min, 37 ° C, une heure), les cellules ont été transférées dans 19 ml de TB fourni avec les antibiotiques appropriés et laissées à croître pendant la nuit. Le cycle de mutagenèse a été répété si cela était jugé nécessaire.

Pour sélectionner des mutants de queue avec une capacité de livraison améliorée, nous avons appliqué un protocole d'optimisation de la transduction. En bref, nous avons choisi trois souches bactériennes pathogènes (Enterobacter cloacae ATCC 23355, Shigella sonnei HNCMB 25021 et E. coli NCTC 13351) sur la base de l'infectivité initiale faible du bactériophage T7. Ces cellules bactériennes cibles ont été cultivées à ~OD600 0,5 (250 tr/min à 37 °C) dans du LB, les cellules ont été placées sur de la glace pendant 15 min, mélangées avec 2 ml de particules de phage dans un rapport volumique de 1:1 et incubées à 37 °C. C et 100 tr/min pendant une heure. Le mélange a ensuite été étalé et placé à 37°C pour croître pendant la nuit. Le même protocole a été réalisé avec des particules porteuses de queue de phage de type sauvage non mutagénisées. Les colonies ont été regroupées le lendemain et l'ADN plasmidique a été isolé à l'aide du kit de mini-préparation de plasmide GeneJET (Thermo Fisher), puis purifié davantage à l'aide de DNA Clean et du Concentrator-5 (kit Zymo Research, D4004). Parmi les plasmides, 100 ng ont été électroporés dans des cellules E. coli BW25113. Après récupération, les cellules ont été alimentées avec les antibiotiques appropriés, étalées sur des plaques de gélose après une heure d'incubation et laissées se développer pendant la nuit. Le jour suivant, les cellules ont été regroupées dans 4 ml de LB, 250 ul ont été transférés dans 40 ml de TB fourni avec les antibiotiques appropriés et cultivées à ~ DO600 0,7 (250 tr/min à 37 ° C). Après croissance, les cellules ont été placées sur de la glace pendant 15 min, centrifugées (2 200 × g, 4 °C, 10 min) et remises en suspension. Ensuite, des cultures cellulaires ont été infectées avec des bactériophages T7∆(gp11-12-17). Après deux heures (100 tr/min à 37 °C), les cellules ont été traitées avec du chloroforme à 2 % et vortexées. Après centrifugation aux paramètres ci-dessus, les phages présents dans le surnageant ont été collectés. La transduction de la souche bactérienne étudiée a été répétée jusqu'à ce que la saturation du nombre de cellules transduites (~ deux ou trois tours) soit observable. Enfin, les plasmides de colonies uniques ont été séquencés pour révéler les mutations de la queue.

Des cellules d'E. coli contenant les plasmides MGP4240 ou MGP4240_gp17V544G et pZE21_p15A ont été infectées avec le phage T7Δ(gp11-12-17) pour empaqueter le plasmide pZE21_p15A. Les particules de phage résultantes ont été utilisées pour générer des lysats de phage dans E. coli BW25113 et S. sonnei HNCMB 25021 hébergeant MGP4240 ou MGP4240_gp17V544G. La présence des plasmides codant pour la queue de phage dans les cellules cibles était nécessaire pour que la contamination par les phages réplicatifs forme des plaques. Pour les essais sur plaque, 4 ml de top agar ont été préparés et complétés avec 100 µg ml-1 de streptomycine (Sigma, S6501-25G) et 400 µl des cultures d'une nuit. Enfin, à partir de chaque stock de phages, 10 µl ont été déposés sur la gélose supérieure dans des dilutions de 1 à 1010 fois.

Pour la livraison de la bibliothèque métagénomique fonctionnelle, la mutation identifiée dans la variante de queue de phage T7 gp17V544G a été introduite dans le plasmide MGP424021 en utilisant une amplification du plasmide entier avec des amorces portant la mutation correspondante, suivie d'un traitement DpnI (Thermo Fisher, ER1701) pour éliminer la matrice méthylée d'origine. ADN plasmidique et électrophorèse sur gel ultérieure, extraction sur gel et auto-ligature. Les plasmides ont ensuite été électroporés dans des cellules E. coli BW25113. Les transformants portant les constructions souhaitées ont été identifiés par PCR et validés par séquençage.

Les sélections fonctionnelles pour la résistance ont été effectuées sur des plaques de gélose Mueller Hinton Broth (Sigma, 90922) contenant un gradient de concentration d'un antibiotique donné (adapté de la réf. 54). Les antibiotiques ont été achetés chez Sigma ou MedChem Express. Le nombre de cellules plaquées couvrait au moins 10 fois la taille de la bibliothèque métagénomique correspondante. Les plaques ont été incubées à 37°C pendant 24h. Pour chaque sélection fonctionnelle, une plaque témoin a été préparée avec le même nombre de cellules contenant le plasmide vide (c'est-à-dire le plasmide sans fragment d'ADN cloné dans le site de clonage multiple) qui a montré la zone inhibitrice du composé antimicrobien pour les cellules sans tout plasmide de résistance. Les clones résistants des bibliothèques ont été isolés en lavant ensemble les colonies sporadiques de la région de la plaque (distale à la zone d'inhibition et contenant une concentration d'antibiotique plus élevée), définie par inspection visuelle par rapport à la zone d'inhibition de la plaque témoin. La moitié de la culture en suspension dans LB a été utilisée pour l'isolement du plasmide (kit de miniprep de plasmide GeneJET; Thermo Fisher, PLN70-1KT), et le reste a été congelé avec du glycérol et stocké à -80 ° C.

Les plasmides conférant la résistance obtenus ont été séquencés avec un pipeline de séquençage hybride (Extended Data Fig. 5) basé sur la réf. 34. Le séquençage à lecture longue identifie les fragments d'ADN métagénomique (inserts) et les deux codes-barres aléatoires de 10 nt de long pré-clonés en amont et en aval (uptag et downtag, respectivement) de chaque fragment d'ADN métagénomique. Des aliquotes de préparations d'ADN plasmidique obtenues à partir de chaque crible ont été regroupées dans un rapport équimolaire. La contamination de l'ADN génomique a été éliminée du mélange par double digestion Lambda-exonucléase et exonucléase-I. L'échantillon résultant a été nettoyé (DNA Clean et Concentrator-5, kit Zymo Research) et quantifié. Ensuite, le mélange plasmidique a été linéarisé en ajoutant 5 U d'endonucléase de restriction SrfI (NEB, R0629S) pour chaque 1 µg d'ADN plasmidique (une h à 37 °C, suivie d'une inactivation à 65 °C pendant 20 min), et l'ADN a été quantifié à l'aide du kit d'analyse à large gamme Qubit dsDNA (Thermo Fisher, Q33266) avant d'appliquer le séquençage à lecture longue Oxford Nanopore. Un séquençage en profondeur à lecture courte parallèle et multiplexé a été appliqué sur chaque préparation d'ADN plasmidique métagénomique fonctionnel (regroupement précédent) pour associer des contigs de nanopores à des échantillons de dépistage (Extended Data Fig. 5). À cette fin, nous avons amplifié les codes à barres up- et downtag sur les préparations de plasmide de chaque expérience de sélection séparément, en utilisant des paires d'amorces directes et inverses spécifiques à Illumina. Chaque paire d'amorces contenait des séquences adaptatrices P5 et P7, respectivement, et des codes-barres de 8 nt pour les sites de multiplexage et d'annelage plasmidique (tableau supplémentaire 11). Nous avons effectué une PCR en utilisant l'ADN polymérase haute fidélité Phusion (Thermo Fisher, F530S) en utilisant le mélange réactionnel suivant : 15 ng d'ADN plasmidique matrice, 4 µl de tampon GC 5×, 0,2 µl d'ADN polymérase haute fidélité Phusion, 0,6 µl de DMSO (diméthyl sulfoxyde), 0,2 mM de dNTP, 0,5 à 0,5 µM d'amorces directes et inverses et de l'eau dans un volume final de 20 µl. Les conditions de thermocycleur suivantes ont été utilisées : 95 °C pendant cinq minutes, 30 cycles de 95 °C pendant 30 s + 59 °C pendant 30 s + 72 °C pendant 5 s, 72 °C pendant sept minutes. Suite à la mesure de la concentration de chaque réaction PCR, nous avons mélangé les échantillons dans un rapport de masse de 1:1. Ensuite, nous avons isolé le mélange de fragments de 137 pb de long à partir d'un gel d'agarose à 0,75 %.

Les bibliothèques ont été préparées en utilisant un kit de séquençage de ligature (Oxford Nanopore Technologies, SQK-LSK109) avec 1 ug d'ADN plasmidique. L'ADN a été préparé avec les kits NEBNext FFPE Repair (M6630S) et Ultra II End Prep (E7546S), purifié à l'aide d'Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63882), puis l'adaptateur a été ligaturé à l'aide de NEBNext Quick T4 DNA ligase (E6056S). Enfin, la bibliothèque adaptée a été purifiée par Agencourt AMPure, quantifiée à l'aide de Qubit 3.0, mélangée avec un tampon d'exécution ONT et des billes de chargement, amorcée avec une Flow Cell FLO-MIN106 9.4.1 SpotON fixée à un appareil MinION et exécutée pendant 72 h. L'algorithme Guppy (v8.25) avec des paramètres de configuration de haute précision a été utilisé pour l'appel de base. Les lectures brutes ont été filtrées sur la base de la valeur de qualité (QC ≥ 7) et de la longueur (4 000 à 8 000 pb) à l'aide de NanoFilt v2.7.155. Les lectures ont été mappées sur la séquence de référence avec minimap2 (v2.17)56 ; Les fichiers SAM ont été convertis en BAM triés ; les séquences d'insertion ont été extraites et les codes-barres ont été identifiés et ajoutés aux noms de lecture/insertion en appliquant la sous-commande samtools tview (1.11-9-ga53817f) 57 ; des fichiers FASTQ individuels ont été créés à l'aide de SEQTK (v0.13.2)58 ; les séquences consensus ont été générées à l'aide de SPOA (v4.0.2)59 avec les paramètres suivants : -l 0 -r 0 -g -2. Enfin, les inserts consensus bruts ont été polis à l'aide de l'ensemble pertinent de séquences d'inserts par minimap2 et racon (v1.4.19) 56 pour créer les inserts consensus finaux avec une couverture d'au moins 100 ×. Les longueurs et les diversités des fragments d'ADN métagénomique livrés ont été déterminées en utilisant un séquençage profond à lecture longue juste après l'électroporation dans E. coli BW25113 et la transduction dans Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium str. LT2, K. pneumoniae NCTC 9131 et S. sonnei HNCMB 25021. Les indices de diversité alpha de Shannon (H) ont été calculés sur la base de la fréquence de chacun des contigs de tous les hôtes en utilisant le package vegan R (2,5-7)60.

Les bibliothèques de séquençage regroupées ont été dénaturées avec du NaOH 0, 1 M, diluées à 12 pM avec du tampon d'hybridation HT1 (Illumina) et mélangées avec une bibliothèque de contrôle de séquençage PhiX Control v3 (Illumina) à 40%. Les pools de séquençage dénaturés ont été chargés sur le kit de réactifs MiSeq V2-300 (Illumina) et 2 lectures de séquences de 70 pb ont été générées avec un instrument Illumina MiSeq avec des amorces de séquençage personnalisées de lecture 1, lecture 2 et index 1 dopées dans les positions de cartouche appropriées (12, 14 et 13, respectivement) à une concentration finale de 0,5 µM.

Les pools de plasmides résistants collectés à partir du crible métagénomique ont été mélangés et retransformés ou réélectroporés dans les quatre hôtes. Des expériences de sélection ont été réalisées sur des plaques de gélose à gradient comme décrit précédemment (voir « Sélection fonctionnelle de la résistance aux antibiotiques » ci-dessus). Des colonies résistantes ont été collectées et après la préparation du plasmide, les codes-barres sur les plasmides ont été séquencés par séquençage Illumina (méthodes supplémentaires). Pour calculer les chevauchements entre les ensembles ARG fonctionnels d'une espèce à l'autre, nous avons d'abord estimé la précision de l'écran en comparant les résultats à ceux des mesures MIC des 13 fragments d'ADN conférant une résistance sélectionnés. Sur la base de ces comparaisons, nous avons estimé les taux de vrais positifs, faux positifs, vrais négatifs et faux négatifs du dépistage. Ensuite, nous avons calculé un indice de Jaccard ajusté pour chaque paire d'espèces, qui prend en compte la précision de l'écran comme suit. Pour chaque espèce, nous avons remplacé le vecteur original de présence/absence d'instances de résistance détectées par un nouveau vecteur où les valeurs originales de présence (absence) ont été conservées au hasard avec une probabilité égale à la valeur prédictive positive (négative) (c'est-à-dire la proportion de vrais positifs parmi tous les cas positifs et la proportion de vrais négatifs parmi tous les cas négatifs). La procédure a été répétée 50 000 fois, et les médianes et les intervalles de confiance à 95 % des indices de Jaccard entre les paires d'espèces ont été calculés.

Nous avons mesuré comment les fragments d'ADN qui confèrent une résistance antibiotique à E. coli influencent la sensibilité de Shigella sonnei HNCMB 25021, K. pneumoniae NCTC 9131 et Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium str. LT2. À cette fin, nous avons utilisé un ensemble représentatif de 13 plasmides qui ont été isolés dans nos écrans de sélection d'antibiotiques. Pour chaque souche, les niveaux de résistance fournis (c'est-à-dire le MIC) ont été mesurés avec une méthode de microdilution standard en 12 étapes dans des plaques à 96 puits, et le changement de pli MIC a été déterminé en les comparant au MIC du vecteur vide correspondant hébergeant contrôler les souches. Les CMI ont été déterminées sur la base de la croissance cellulaire (DO600) après 24 h d'incubation (37 °C, 180 tr/min).

Chaque séquence d'insert consensus issue du séquençage des nanopores a été associée à des échantillons de dépistage (hôte, résistome, antibiotique) en combinant les ensembles de données Nanopore et Illumina via les codes-barres uptag et downtag uniques avec un script R personnalisé. Pour identifier les ARG dans les contigs métagénomiques, deux approches parallèles ont été utilisées : (1) la prédiction du cadre de lecture ouvert (ORF) avec prodigal 61, suivie d'une annotation avec la recherche BLASTP dans les bases de données CARD35 et ResFinder36, avec une couverture > 50 bp à la valeur e < 10−5 et (2) Recherche BLASTX avec les mêmes paramètres mais sans prédiction ORF pour diminuer le risque d'ORF tronqués en raison d'erreurs de séquençage par décalage de trame. Pour supprimer les données de séquençage basse fidélité de l'ensemble de données, les fragments d'ADN métagénomique pris en charge par <10 séquences d'insertion consensus dans l'ensemble de données nanopore et <9 lectures dans l'ensemble de données de codes à barres Illumina uptag et downtag ont été filtrés.

Si un fragment d'ADN métagénomique contenait plus d'un ARG prédit, les ARG connus pour agir sur une classe d'antibiotiques (basée sur les bases de données de référence CARD et ResFinder) autre que celle que nous avons utilisée dans l'expérience de sélection ont été filtrés. Les séquences ARG ayant au moins 95 % d'identité et de couverture au niveau de la séquence d'ADN ont été regroupées en clusters ARG37. Chaque cluster était représenté par le résultat le plus proche des ARG connus dans les bases de données Card35 et ResFinder36 (tableau supplémentaire 6). Les organismes donneurs à l'origine des séquences de contigs d'ADN assemblées ont été identifiés par recherche de similarité de séquences de nucléotides en utilisant les contigs d'ADN comme requête par rapport à la base de données NCBI Reference Prokaryotic (RefProk, téléchargée le 21 mars 2021) avec une valeur e seuil de 10-10. La hiérarchie taxonomique (royaume, phylum, classe, ordre, famille, genre, espèce) a été acquise à l'aide du package taxonomizr dans R (v0.8.0).

Pour créer le catalogue de gènes mobiles (c'est-à-dire une base de données de séquences d'ADN récemment transférées entre des espèces bactériennes40), nous avons téléchargé 1 377 génomes de diverses espèces bactériennes liées à l'homme à partir de la base de données Integrated Microbial Genomes and Microbiomes comme précédemment40 et 1 417 génomes de Gram- pathogènes ESKAPE négatifs de la base de données NCBI RefSeq (tableau supplémentaire 8). En utilisant NCBI blastn 2.10.1+62, nous avons recherché les séquences nucléotidiques partagées entre les génomes appartenant à différentes espèces. Les paramètres de filtrage des résultats NCBI blastn 2.10.1+ blast étaient les suivants : pourcentage minimum d'identité, 99 % ; longueur d'alignement minimale, 500 ; longueur d'alignement maximale, 20 000. Les coups de souffle ont été regroupés par cd-hit-est 4.8.163,64, avec un seuil d'identité de séquence de 99 %. Nous avons prédit les ORF sur les coups de souffle avec prodigal v2.6.361, en ne gardant que ceux de plus de 500 nt. Ensuite, pour générer le catalogue de gènes mobiles, nous les avons comparés avec les bases de données fusionnées CARD 3.1.035 et ResFinder (d48a0fe)36 en utilisant diamond v2.0.4.14265. Enfin, des séquences plasmidiques naturelles ont été identifiées en téléchargeant 27 939 séquences plasmidiques complètes à partir de la base de données PLSDB (v2020-11-19)41. Ensuite, des séquences représentatives des 114 clusters ARG isolés ont été recherchées au BLASTN à la fois dans le catalogue de gènes mobiles et dans des séquences plasmidiques naturelles, avec un seuil d'identité et de couverture de 90 %. Les ARG présents dans le catalogue de gènes mobiles et/ou dans les séquences plasmidiques naturelles ont été considérés comme mobiles.

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de R (v4.1.1). Le test t paramétrique à deux échantillons a été utilisé pour évaluer les différences entre les moyennes des groupes d'échantillons. Le test exact de Fisher a été utilisé pour déterminer les associations significatives entre deux variables. L'indice de diversité alpha de Shannon a été utilisé pour caractériser la diversité des contigs d'ADN dans les bibliothèques à l'aide du package végétalien (v2.5–7) dans R66. La distribution des données était supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les lectures Illumina et les contigs Nanopore pour cette étude ont été déposés dans l'European Nucleotide Archive (ENA) à l'EMBL-EBI sous le numéro d'accession PRJEB54063 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB54063). Les données sources sont fournies avec ce document.

Les scripts et autres fichiers nécessaires pour reproduire l'analyse sont disponibles sur https://github.com/stitam/Apjok-et-al-DEEPMINE-NatMicrobiol.

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Nous remercions D. Verma du Département de microbiologie et B. Bhimrao de l'Université Ambedkar, Lucknow, Inde pour leur aide dans la collecte d'échantillons de sol et l'approbation de la NBA. Ce travail a été soutenu par les subventions du Laboratoire national de biotechnologie NKFIH-871-3/2020 et 2022-2.1.1-NL-2022-00008 (BK et CP); le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention no. 739593 (BP et BK); le Conseil européen de la recherche H2020-ERC-2014-CoG 648364-Resistance Evolution (CP) et H2020-ERC-2019-PoC 862077–Aware (CP) ; Bourse du Bureau national de la recherche, du développement et de l'innovation FK-135245 (BK) et FK-124254 (OM); l'Office national de la recherche, du développement et de l'innovation et le ministère de l'Innovation et de la Technologie dans le cadre du programme "Frontline" KKP 129814 et 126506 (BP et CP); le Laboratoire National de Sécurité Sanitaire RRF-2.3.1-21-2022-00006 (BP), GINOP-2.3.2–15–2016–00014 (EVOMER, CP et BP), GINOP-2.3.2–15–2016– 00020 (MolMedEx TUMORDNS, CP), GINOP-2.3.2-15-2016-00035 (NZ); une bourse de recherche János Bolyai de l'Académie hongroise des sciences (BO/352/20 (BK), BO/00303/19/8 (OM)); Nouveau programme national d'excellence du ministère des Capacités humaines (UNKP-20-5-SZTE-654 et UNKP-21-5-SZTE-579, BK) ; Nouveau programme national d'excellence du ministère de l'Innovation et de la Technologie financé par le Fonds national pour la recherche, le développement et l'innovation (ÚNKP-20-3 -SZTE-452, GA) ; le programme de bourses d'études doctorales du programme doctoral coopératif du ministère de l'Innovation et de la Technologie financé par le Fonds national de la recherche, du développement et de l'innovation (KDP-17-4/PALY-2021, C992025, MS). RH, BG, PU et AG ont été soutenus par GINOP-2.3.4-15-2020-00010, GINOP-2.3.1-20-2020-00001, BECOMING-2019–1-HU01-KA203–061251, l'Horizon de l'Union européenne Programme de recherche et d'innovation 2020 dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie no. 754432 et le ministère polonais des sciences et de l'enseignement supérieur, à partir des ressources financières pour la science en 2018-2023. Ce travail de recherche a été mené avec le soutien du programme d'éducation de l'Académie nationale des scientifiques de la Fondation biomédicale nationale sous le parrainage du ministère hongrois de la Culture et de l'Innovation (DK).

Pramod K. Jangir

Adresse actuelle : Département de zoologie, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Gábor Apjok, Mónika Számel et Chryso Christodoulou.

Unité de biologie synthétique et systémique, Institut de biochimie, Centre de recherche biologique, Laboratoire national de biotechnologie, Réseau de recherche Eötvös Loránd (ELKH), Szeged, Hongrie

Gábor Apjok, Mónika Számel, Chryso Christodoulou, Viktória Seregi, Bálint Márk Vásárheyi, Tamás Stirling, Bálint Eszenyi, Tóbiás Sári, Fanni Vidovic Orsolya Méhi, Pramod K. Jangir, Gábor Draskovits, Ákos Nyerges, Gergely Fekete, Balázs Papp, Pál Csaba & Bálint Kintses

École doctorale de biologie, Université de Szeged, Szeged, Hongrie

Gábor Apjok, Mónika Számel, Tamás Stirling, Tóbiás Sári & Pramod K. Jangir

HCEMM-BRC Translational Microbiology Research Group, Szeged, Hongrie

Viktória Seregi & Balint Kintses

Institut de biochimie, Centre de recherche biologique, Laboratoire national pour la sécurité sanitaire, Réseau de recherche Eötvös Loránd (ELKH), Szeged, Hongrie

Tamás Stirling & Balázs Papp

École doctorale des sciences médicales multidisciplinaires, Université de Szeged, Szeged, Hongrie

Pétra Szili

Groupe de recherche en bioinformatique, Plateforme de génomique et de bioinformatique, Centre de recherche Szentágothai, Université de Pécs, Pécs, Hongrie

Robert Herczeg, Bence Gálik, Péter Urbán & Attila Gyenesei

Département de biologie moléculaire clinique, Université médicale de Bialystok, Bialystok, Pologne

Bence Galik & Attila Gyenesei

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Faculté des sciences et d'informatique, Université de Szeged, Szeged, Hongrie

László Bodai & Bálint Kintses

Département de génétique, Faculté des sciences et d'informatique, Université de Szeged, Szeged, Hongrie

Nora Zsindely

Direction du diagnostic vétérinaire, Office national de la sécurité de la chaîne alimentaire, Budapest, Hongrie

Denes Béla

Département de microbiologie clinique et d'immunologie, École de médecine Sackler, Université de Tel Aviv, Tel Aviv, Israël

Ido Yossef et Udi Qimron

Laboratoire de biologie des systèmes métaboliques HCEMM-BRC, Szeged, Hongrie

Balázs Papp

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GA et BK ont conçu le projet. MS, GA, CC, BMV, T.Sári, EN, PKJ, AN, CP et BK ont planifié les expériences et les analyses de données. MS, GA, VS, DK, IIL, FV, BE, T.Sári, PS, EN, OM, GD, BD ont réalisé les expériences. LB, NZ ont effectué le séquençage Illumina, RH, BG, PU, ​​AG ont effectué le séquençage Nanopore. MS, GA, CC, BMV, T.Stirling, GF, RH, BP, CP et BK ont analysé les données expérimentales et effectué des analyses bioinformatiques. BK, CP, CC, MS et GA ont rédigé le manuscrit avec les contributions de tous les auteurs.

Correspondance à Pál Csaba ou Bálint Kintses.

GA, MS, T.Sári, OM, UQ et BK sont les inventeurs d'une demande de brevet déposée auprès de DEEPMINE (Office européen des brevets). Le Biological Research Center Szeged détient un brevet actif sur DIVERGE (PCT/EP2017/082574, US 10,669,537 B2, European Patent No. 3526327), dont BK et CP sont les inventeurs. UQ est le directeur de la technologie de Trobix Innovation Ltd. et est l'inventeur d'une demande de brevet en instance sur une méthode pour générer des variants de bactériophages ayant des gammes d'hôtes étendues (PCT/IL2017/050734). Tous les autres auteurs n'ont pas d'intérêts concurrents.

Nature Microbiology remercie Trevor Charles, Kevin Forsberg et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Comparaison des efficacités d'électroporation et de transduction. La figure montre que le nombre maximal de plasmides délivrés aux hôtes est d'au moins deux ordres de grandeur plus élevé par transduction que par électroporation chez les 3 espèces hôtes pathogènes (les barres centrales et d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard (n = 3 expériences biologiquement indépendantes) ). Données disponibles dans le tableau supplémentaire 2. b, inserts métagénomiques amplifiés par PCR à partir de cellules transduites. Après transduction et électroporation, les fragments d'ADN métagénomique ont été amplifiés par PCR en utilisant des amorces spécifiques de plasmide des deux côtés du fragment d'ADN métagénomique, puis séquencés par séquençage capillaire. Cette expérience différencie les cellules monoclonales (produit de PCR unique et séquence d'ADN) de celles qui ont été co-transduites par deux ou plusieurs plasmides (doubles bandes sur le gel et signal mixte dans la séquence capillaire). La PCR a été répétée dans le cas de chaque paire hôte-bibliothèque avec des résultats similaires. c, Lors de la génération de particules de bactériophage transducteur, une grande partie des phages reste réplicative et tue les cellules bactériennes utilisées pour la génération de phages. Par conséquent, avec l'augmentation de la concentration en phages, l'efficacité de la transduction n'augmente pas comme on pourrait s'y attendre, mais diminue. La figure montre l'efficacité de transduction de la particule de phage transducteur T7 hébergeant la queue du phage T7 (ligne noire) sur Shigella sonnei HNCMB 25021 à différentes dilutions (voir Méthodes). La ligne pointillée rouge montre l'augmentation attendue de l'efficacité de la transduction sans aucun effet de destruction détectable des phages réplicatifs. Données disponibles dans le tableau supplémentaire 2.

Données source

a, Les HRDR gp17 T7 mutants portent généralement des combinaisons spécifiques de mutations, dont 28 % ont été décrites précédemment comme des mutations adaptatives. Carte thermique représentant le nombre de cas où une mutation se produit dans les 50 HRDR de queue de phage T7 séquencés. Les mutations adaptatives selon (Huss et al.28) sont indiquées par un point rouge. La combinaison fréquente de mutations adaptatives spécifiques indique le potentiel de DIvERGE pour trouver des mutations altérant la spécificité de l'hôte avec une grande efficacité. Données disponibles dans le tableau supplémentaire 4. b,c, Distribution des mutations détectées dans les gènes de fibre de queue de phage mutagénisés Escherichia phage T7 gp17 et Salmonella phage ΦSG-JL2 gp17. Les HRDR prédits se distinguent par des régions colorisées comme dans (Yehl et al.29) avec le bactériophage T3. d, efficacités de transduction des queues de phage mutantes T7 (gris) et ΦSG-JL2 (jaune) par rapport à leurs homologues de type sauvage avec la souche déficiente en LPS E. coli K12 BW25113 ΔtrxAΔwaaR. L'axe Y montre le nombre de cellules transduites dans 1 mL. Les barres du centre et de l'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard (n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Notez que nous n'avons observé aucun mutant enrichi en Salmonella phage Vi06 gp43, ce qui indique que la fibre de queue du phage Salmonella Vi06 se lie à un récepteur de surface cellulaire autre que le LPS. Données disponibles dans le tableau supplémentaire 4.

Données source

a, Représentation schématique de la génération de particules de phage de transduction avec T7 gp17WT. Au cours de la première étape du processus, le bactériophage T7 dépourvu de ses gènes codant pour la fibre de queue dans son génome mais affichant autrement la fibre de queue T7 de type sauvage infecte la cellule E. coli BW25113 portant le plasmide métagénomique et une queue de phage exprimant le plasmide. L'infection se traduit par la production de particules de phage portant soit le plasmide métagénomique (particule de phage transducteur) soit le génome du phage (phage réplicatif) selon Yosef et al. Si la queue de phage codée par la queue de phage exprimant le plasmide (et donc affichée sur les particules T7 générées) peut infecter efficacement E. coli, le phage réplicatif s'accumule continuellement au cours du processus, puisque le génome du phage contenant la particule de phage peut initier une nouvelle reproduction. cycle. b, Le nombre de plasmides métagénomiques délivrés dans Shigella sonnei HNCMB 25021 par les particules de phage T7 hébergeant des fibres de queue gp17WT (bleu) ou gp17V544G (vert) (test t unilatéral à deux échantillons, P = 0,01944. Centre et erreur les barres représentent la moyenne et l'erreur standard, n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 5. c, Contamination par les phages réplicatifs mesurée par la formation de plaques des particules de phages transducteurs T7 hébergeant les fibres de queue gp17WT (bleu) ou gp17V544G (vert) (voir Méthodes). Le test de plaque a été effectué à la fois avec E. coli BW25113 et avec S. sonnei HNCMB 25021 (test t bilatéral à deux échantillons, P = 0,000168 et P = 0,013476 lorsqu'il est appliqué avec E. coli et S. sonnei, respectivement. Centre et les barres d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard ; n = 3 expériences biologiquement indépendantes). Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 5. d, Contamination par les phages réplicatifs mesurée par les nombres de colonies transduites de S. sonnei HNCMB 25021 avec des particules de phage T7 hébergeant les fibres de queue gp17WT (bleu) ou gp17V544G (vert). Une quantité inférieure de phage réplicatif dans l'échantillon de particules de transduction T7 gp17V544G est indiquée par l'augmentation du nombre de colonies même à des concentrations élevées de la particule de transduction. Notamment, contrairement à la Fig. 5c supplémentaire, l'activité de phage réplicatif est détectée à la concentration la plus élevée de la particule de transduction dans cette expérience. (n = 2 répétitions biologiques. Les barres centrales et d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard.) Données disponibles dans le tableau supplémentaire 5. e, Efficacité de transduction des particules de phage T7 hébergeant des fibres de queue gp17WT (bleu) ou gp17V544G (vert) dans E. coli BW25113 (test t bilatéral à deux échantillons, P = 0,00553, n = 3 expériences biologiquement indépendantes. Les barres du centre et d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard). Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 5. f, Représentation schématique du schéma supposé de génération de particules de phage transducteur avec T7 gp17V544G. La diminution de l'efficacité de transduction pour E. coli BW25113 abolit la reproduction du phage réplicatif après le premier cycle d'infection. A noter que le premier cycle d'infection est réalisé par le T7 gp17WT. En somme, l'infection inefficace d'E. coli par la queue du phage mutant entraîne une quantité inférieure de phages réplicatifs.

Données source

a, La livraison de la bibliothèque de plasmides métagénomiques fonctionnels est aussi efficace par les particules de bactériophage T7 gp17V544G dans Shigella sonnei HNCMB 25021 que par électroporation dans E. coli BW25113 (P = 0,19769, test t unilatéral à deux échantillons, n = 3 expériences biologiquement indépendantes. Les barres centrales et d'erreur représentent la moyenne et l'erreur standard.) Données disponibles dans le tableau supplémentaire 2. b,c, longueurs et diversités des fragments d'ADN métagénomiques livrés, respectivement, déterminées en utilisant un séquençage profond à lecture longue juste après l'électroporation et la transduction (méthodes). Les lignes pointillées représentent la taille moyenne des fragments d'ADN. Les indices de diversité alpha de Shannon (H) ont été calculés sur la base de la fréquence des fragments avec des séquences identiques dans les bibliothèques (n = 276899, n = 162107, pour E. coli et S. sonnei, respectivement). Données disponibles dans le tableau supplémentaire 3.

Données source

Le pipeline ressemble à un flux de travail précédemment publié (Dual Barcode Shotgun Expression Library Sequencing pipeline (Mutalik et al.34)) avec une modification qui évite l'amplification par PCR des fragments d'ADN métagénomique conférant une résistance et, par conséquent, préserve la composition originale des échantillons (Méthodes ). Le flux de travail comprend les étapes suivantes. Tout d'abord, tous les plasmides métagénomiques fonctionnels obtenus à partir des cribles ont été regroupés puis linéarisés à l'aide de l'endonucléase de restriction SrfI. SrfI a une séquence de reconnaissance longue de huit paires de bases pour minimiser la digestion de l'insert métagénomique. Les plasmides linéarisés sont ensuite soumis à un séquençage à lecture longue Nanopore (Méthodes). Le séquençage à lecture longue identifie le fragment d'ADN métagénomique (insert) et les deux codes à barres aléatoires de 10 nucléotides de long pré-clonés en amont et en aval (Uptag et Downtag, respectivement) de chaque fragment d'ADN métagénomique (Méthodes). Parallèlement, avant de regrouper les plasmides métagénomiques de chaque écran, un séquençage en profondeur à lecture courte multiplexé a été appliqué pour lire les codes-barres uniques codés par plasmide de chaque côté des fragments métagénomiques dans chaque écran métagénomique fonctionnel. Plus précisément, les séquences Uptag et Downtag ont été amplifiées par PCR avec des amorces compatibles avec le séquençage Illumina à code-barres (BC). Après le séquençage illumina et le démultiplexage des échantillons à l'aide des codes-barres BC, les ensembles de données Nanopore et Illumina sont combinés pour attribuer chaque plasmide (identifié par les balises Up- et Downtags) à un lot de dépistage qui est une combinaison unique d'hôte, d'antibiotique et de bibliothèque.

a, Pourcentage d'ARG identifiés dans chacun des quatre hôtes de manière unique (bleu) et en chevauchement avec au moins un hôte supplémentaire (rouge). E. coli n'a identifié que 57 % des 114 ARG. b, En moyenne, seuls 44 % (marqués par une ligne pointillée horizontale) des ARG détectés se chevauchent entre les paires d'espèces après avoir pris en compte la variabilité des écrans répétés (83 %), c'est-à-dire en divisant le pourcentage de chevauchement entre les paires d'espèces par le pourcentage de chevauchement entre les écrans répétés (0,365/0,83). Données disponibles dans le fichier de données source 6. Les boîtes à moustaches montrent la médiane (ligne horizontale centrale), les premier et troisième quartiles (bas et haut de la boîte, respectivement), avec des moustaches montrant soit la valeur maximale (minimale) soit 1,5 fois l'intervalle interquartile de les données; n = 80 pour E. coli, n = 101 pour K. pneumoniae, n = 56 pour S. enterica et n = 37 pour S. sonnei, où 'n' est le nombre d'ARG identifiés dans l'hôte donné). Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 6.

a, La figure montre le nombre d'ARG provenant de différents groupes phylogénétiques et la distribution de chaque groupe à travers les hôtes et les résistomes (n = 114). La majorité des ARG proviennent de protéobactéries. Données disponibles dans le fichier de données source 7. b, La figure montre le nombre d'ARG identifiés dans les différentes catégories mécanistes et la compatibilité fonctionnelle de chaque catégorie avec plusieurs hôtes (n = 114). Les catégories les plus fréquentes étaient l'inactivation antibiotique, l'efflux antibiotique et les régulateurs de l'efflux antibiotique. Données disponibles dans le tableau supplémentaire 7.

a, une proportion significativement plus élevée d'ARG non détectés pour fournir un phénotype de résistance chez une espèce était présente sur un seul fragment d'ADN conférant une résistance par rapport aux ARG détectés pour fournir un phénotype de résistance chez au moins une espèce (Two-tailed Fisher's test exact, P = 0,032, n = 80, tableau supplémentaire 10). b, Précision estimée de l'écran basée sur la prise des mesures MIC comme ensemble de données étalon-or. Notez que nous avons exclu un ARG (QnrB73) des mesures MIC, car la réintroduction de cet ARG dans chacune des quatre espèces bactériennes hôtes n'a pas été confirmée par le séquençage de la bibliothèque de plasmides (fichier de données source 9). La présence de résistance dans l'ensemble de données CMI a été définie comme un changement de plus du double de la valeur CMI relative. Les faux résultats négatifs sont les ARG qui n'ont pas été détectés à l'écran mais qui ont montré un phénotype de résistance dans les mesures MIC. Les faux résultats positifs sont ceux qui n'ont pas fourni de résistance dans les mesures MIC mais ont été détectés pour montrer un phénotype de résistance dans le dépistage. Nous avons supposé que l'auto-stop plasmidique était la principale source de faux positifs. Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 9c, La distribution des coefficients de similarité Jaccard ajustés qui représentent les chevauchements des ensembles ARG fonctionnels entre les paires d'espèces hôtes après avoir contrôlé la précision des mesures à l'aide d'une approche stochastique (Méthodes). La ligne pointillée, la ligne bleue et les lignes rouges représentent le coefficient de similarité de Jaccard mesuré pour les paires d'espèces hôtes, la médiane des coefficients de similarité de Jaccard ajustés et les limites inférieure et supérieure des intervalles de confiance à 95 %, respectivement. d, Au total, seuls ~ 46% des ARG (~ 29 sur 63) sont estimés fournir une résistance chez les quatre espèces hôtes bactériennes. L'histogramme montre le nombre d'ARG qui sont estimés conférer une résistance aux quatre espèces hôtes en tenant compte des taux de faux positifs et de faux négatifs du dépistage en utilisant une approche stochastique (voir Méthodes). La ligne pointillée, la ligne bleue et les lignes rouges représentent le coefficient de similarité de Jaccard mesuré pour les paires d'espèces hôtes, la médiane des coefficients de similarité de Jaccard ajustés et les limites inférieure et supérieure des intervalles de confiance à 95 %, respectivement. (voir Méthodes).

a, Le nombre total d'ARG est statistiquement le même pour les anciens et les nouveaux groupes d'antibiotiques, quels que soient les microbiomes pris en compte. (sol anthropique : P = 0,4377, associé à l'homme (intestin/clinique) : P = 0,601, test t bilatéral à deux échantillons de Welch, n = 5 et n = 5 pour les nouveaux et les anciens, où « n » représente le nombre d'antibiotiques, respectivement ; les boîtes à moustaches montrent la médiane (ligne horizontale centrale), les premier et troisième quartiles (bas et haut de la boîte, respectivement), avec des moustaches montrant soit la valeur maximale (minimale) soit 1,5 fois l'intervalle interquartile des données ). b, Les résultats ci-dessus sont restés lorsque l'analyse a été limitée aux ARG avec des événements de transfert de gènes horizontaux établis (sol anthropique : P = 0,1994, test t bilatéral à deux échantillons de Welch, n = 3 et n = 2 pour les nouveaux et les anciens, où « n » représente le nombre d'antibiotiques, respectivement ; associé à l'homme (intestin/clinique) : P = 0,6426, test t de Welch à deux échantillons, n = 4 et n = 5, pour les nouveaux et les anciens, respectivement). Les données sont disponibles dans le tableau supplémentaire 7.

Méthodes supplémentaires, Description du tableau de données étendu 1, Tableaux supplémentaires 1 à 11 et Données source Données étendues Figs. 1–4.

Tableaux supplémentaires 1 à 11.

Numérisation non recadrée de l'image du gel dans Extended Data Fig. 1 (Klebsiella pneumoniae NCTC 9131 + bibliothèque de sol par le phage K11).

Numérisation non recadrée de l'image du gel dans Extended Data Fig. 2 (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2 + Gut library by ΦSG-JL2 phage).

Numérisation non recadrée de l'image du gel dans Extended Data Fig. 3 (Salmonella enterica subsp. enterica sérotype Typhimurium str. LT2 + Bibliothèque clinique par le phage ΦSG-JL2).

Numérisation non recadrée de l'image du gel dans Extended Data Fig. 4 (électroporation dans Escherichia coli K12 BW25113).

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Réimpressions et autorisations

Apjok, G., Szamel, M., Christodoulou, C. et al. Caractérisation des résistomes antibiotiques par métagénomique fonctionnelle reprogrammée activée par les bactériophages dans les souches cliniques. Nat Microbiol 8, 410–423 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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Reçu : 26 novembre 2021

Accepté : 04 janvier 2023

Publié: 09 février 2023

Date d'émission : Mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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