Le noyau cholinergique du cerveau antérieur basal de Meynert régule la douleur chronique

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5014 (2022) Citer cet article

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Le noyau basal de Meynert (NBM) assure des fonctions essentielles dans l'attention, l'éveil et la cognition via sa profonde modulation de l'activité néocorticale et émerge comme une cible clé dans les démences d'Alzheimer et de Parkinson. Malgré le rôle crucial des domaines néocorticaux dans la perception de la douleur, le NBM n'a cependant pas été étudié dans des modèles de douleur chronique. Ici, en utilisant des enregistrements de tétrode in vivo chez des souris comportementales, nous rapportons que l'activité oscillatoire bêta et gamma est évoquée dans le NBM par des stimuli nocifs et est facilitée au pic du comportement inflammatoire de type douleur. Des manipulations optogénétiques et chimiogénétiques spécifiques aux cellules et réversibles des neurones cholinergiques-GABAergiques NBM révèlent leur rôle dans le contrôle endogène de l'hypersensibilité nociceptive, qui se manifeste par des projections vers le cortex prélimbique, entraînant une antinociception médiée par la couche 5. Nos données révèlent l'importance du NBM dans le contrôle descendant du traitement néocortical du comportement douloureux.

Un obstacle majeur à une thérapie adéquate des troubles de la douleur chronique est donné par une connaissance incomplète des circuits cérébraux sous-jacents à la perception de la douleur et à leur modulation lors de la transition de la douleur aiguë à la douleur chronique. Leur élucidation est donc importante pour obtenir des informations mécanistes ainsi que pour le progrès thérapeutique. Des études récentes sur l'interrogation fonctionnelle des circuits cérébraux ont conduit à des percées sur les propriétés structure-fonction de certains réseaux cérébraux impliqués dans la douleur, et ont notamment révélé des rôles clés pour les domaines néocorticaux1. La perception de la douleur est sujette à une profonde modulation par des facteurs contextuels, environnementaux et psychosociaux. En tant que mécanismes neuronaux contributifs, des connaissances émergent maintenant sur la modulation du traitement néocortical par l'apport afférent des voies GABAergiques, dopaminergiques et sérotoninergiques2.

En comparaison, on sait très peu de choses sur la portée et les fonctions des voies cholinergiques dans le cerveau dans la modulation de la perception de la douleur. Cela contraste avec les études pharmacologiques approfondies des deux dernières décennies, qui rapportent les effets de la signalisation cholinergique via les récepteurs nicotiniques ionotropes ainsi que les récepteurs muscariniques métabotropes sur la douleur et l'analgésie3. L'administration systémique, périphérique et spinale de ligands cholinergiques module la nociception et des études avec administration centrale ont impliqué la signalisation cholinergique dans l'analgésie opioïdergique et les systèmes modulateurs descendants. Cependant, il y a eu très peu de progrès dans l'exploitation de la modulation cholinergique vers le soulagement de la douleur, principalement en raison de lacunes majeures dans la compréhension des circuits sous-jacents, en particulier en ce qui concerne la délimitation de l'origine des entrées cholinergiques. Ceci est particulièrement important car les effets facilitateurs et inhibiteurs sont associés à la modulation pharmacologique des récepteurs cholinergiques, qui peut être attribuée non seulement à la diversité de la signalisation médiée par les récepteurs, mais également au locus de la modulation cholinergique dans le système nerveux.

Dans le cerveau, les neurones cholinergiques sont abondants soit sous forme d'interneurones locaux dans des zones spécifiques, comme le putamen caudé, soit organisés dans les noyaux cholinergiques Ch1–Ch6 du prosencéphale basal et du tronc cérébral pour fonctionner comme des neurones de projection avec des cibles distantes4. Parmi ceux-ci, le système basal du cerveau antérieur comprend des groupes discrets de cellules cholinergiques (Ch1-Ch4), avec des neurones dans le septum médial (MS) et le membre vertical de la bande diagonale de Broca (vDB) ciblant principalement l'hippocampe, tandis que les neurones dans Ch4 représente en grande partie l'apport cholinergique dans le manteau néocortical et se projette également vers l'amygdale4. Dans le cerveau des rongeurs, la structure la plus analogue au Ch4 est donnée par le noyau basalis magnocellularis (NBM; noyau basal de Meynert), s'étendant également dans une bande ventrale à la commissure antérieure appelée substantia innominata, qui sont collectivement désignées sous le terme NBM dans cette étude, cohérent avec plusieurs autres études publiées (par exemple, réf. 5; vue schématique sur la Fig. 1a). Ce secteur contient la plus grande partie des projections corticopétales du cerveau antérieur basal et est de nature extrêmement cholinergique. Le NBM s'est vu attribuer un rôle modulateur dans des fonctions clés spécifiques, telles que l'éveil, l'attention, la peur et les interactions sociales, y compris la mémoire de reconnaissance sociale5. De plus, le NBM a été impliqué dans l'amélioration de l'acuité du traitement sensoriel en améliorant le rapport "signal sur bruit" dans les circuits corticaux via des mécanismes nicotiniques et muscariniques impliquant à la fois des neurones pyramidaux et des interneurones GABAergiques6,7. Ces propriétés placent potentiellement le NBM dans une position critique pour moduler la perception de la douleur et sa plasticité, compte tenu de l'importance du traitement néocortical dans la douleur1. Étonnamment, cependant, le NBM n'a guère été étudié dans le contexte de la douleur, à l'exception de quelques études avec des lésions excitotoxiques et une large ablation médiée par la toxine des groupes cholinergiques. Il est important de noter qu'aucune étude n'a délimité de manière fonctionnelle les circuits natifs sous-jacents. De plus, on ignore si et comment les schémas d'activité du NBM changent en association avec la douleur et le NBM subit une plasticité lors de la transition vers la douleur chronique in vivo.

a Schéma des principaux noyaux cholinergiques dans le cerveau de souris (b, c) Exemples typiques (a) et quantification (b) de l'augmentation induite par la capsaïcine de l'immunohistochimie Fos dans les neurones cholinergiques NBM (ChAT + ve ; flèches : cellules co-marquées). n = 3 souris/groupe ; P < 0,05 (*0,0103, #0,0263), ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Sidak. d Représentation schématique (provenant de la réf. 31) d'enregistrements de tétrode in vivo dans le NBM (flèche blanche : lésion de la pointe de l'électrode en coupe) en réponse à la stimulation mécanique de von Frey de la patte arrière. e Représentation temps-fréquence moyenne de la modulation spectrale dans le NBM pour tous les essais avec réponse de retrait de la patte aux filaments faibles (0,07 g et 0,16 g) ou aux filaments forts (0,6 g et 1 g). f, g Quantification correspondante de la puissance (f) de l'activité oscillatoire dans les gammes de fréquences thêta (4–8 Hz), alpha (8–14 Hz), bêta (14–30 Hz) et gamma (30–100 Hz), représentée par % de changement dans la période post-application de 2 s sur une activité de base de 1 s avant l'application du stimulus, et évolution temporelle correspondante (g) ; ligne bleue verticale : moment du retrait de la patte. Dans e, g, n = 5 souris ; *P < 0,05 ; Le test t à un échantillon (bilatéral) a été utilisé en f ; Les valeurs de t et P pour les différents groupes sont les suivantes : Filaments faibles : t = 2,06, 1,89, 3,10, 2,60 ; P = 0,108, 0,132, 0,036, 0,060 ; Filaments forts : t = 2,50, 2,57, 3,07, 3,81 ; P = 0,067, 0,062, 0,037, 0,019 ; pour thêta, alpha, bêta et gamma, respectivement. Une ANOVA à mesures répétées unidirectionnelle avec la multi-comparaison de Dunnet par rapport à la ligne de base de pré-stimulation a été utilisée en g (*P = 0,0058, 0,0007, 0,0143, 0,0048, 0,0021, 0,0019, 0,0106, 0,0013, 0,0005, 0,0007, 0,0001, 0 .0028, 0.0013, 0,0006, 0,0011, 0,0148 pour bêta et 0,0091, 0,0002, 0,0045, 0,0012, 0,0001, 0,0022, 0,0036, 0,0016, 0,0005, 0,0012, 0,0451, 0,001 5, 0,0124, 0,0197 pour les intervalles de temps de puissance gamma, de gauche à droite, respectivement). Les barres d'échelle représentent 0,5 mm et 50 µm (à droite) en b et 250 µm en d. Noyau septal médial MS, bande diagonale vDB de Broca, noyau tegmental latérodorsal LDT, noyau tegmental pédonculopontin PPT, cortex préfrontal médial mPFC, commissure antérieure ac, putamen caudé CPu, GP glopus pallidus, noyau LOT du tractus olfactif latéral, faisceau médial du prosencéphale mfb , ic capsule interne, potentiel événementiel ERP ou perturbation. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- erreur standard de la moyenne (SEM).

Ici, nous avons effectué des enregistrements in vivo à l'aide de tétrodes pour capturer dynamiquement les changements d'activité de neurones uniques ainsi que les rythmes de champ oscillatoire dans le NBM chez des souris se déplaçant librement et se comportant pendant la nociception et la transition vers l'hypersensibilité inflammatoire. Nous rapportons des réponses spécifiques du NBM aux stimuli induisant de la douleur (nocifs), qui démontrent un changement de réactivité aux stimuli de faible intensité dans un modèle de douleur inflammatoire, reflétant ainsi l'hypersensibilité comportementale. Simultanément, les rythmes oscillatoires gamma et bêta subissent une potentialisation de la puissance spectrale. En utilisant des manipulations chimiogénétiques et optogénétiques réversibles et spécifiques au type de cellule en conjonction avec le comportement, nous démontrons que cette potentialisation de l'activité cholinergique dans le NBM et ses projections sur le cortex préfrontal supprime l'hypersensibilité nociceptive dans les conditions de douleur inflammatoire et neuropathique, ouvrant ainsi la voie à stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement ces groupes cellulaires cholinergiques.

L'injection intraplantaire de capsaïcine dans le membre postérieur de souris de type sauvage, qui induit de manière aiguë une douleur forte et tonique, a entraîné une augmentation significative de l'expression du produit génique précoce immédiat dépendant de l'activité, Fos, dans le NBM (schématiquement illustré à la Fig. 1a), y compris les neurones cholinergiques comme on le voit via le co-marquage pour le marqueur choline acétyltransférase (ChAT; Fig. 1b). Nous avons ensuite ciblé ce domaine dans des expériences d'électrophysiologie chez des souris éveillées et comportementales pour étudier directement les changements dans l'activité NBM, à la fois au niveau des potentiels de champ et des cellules individuelles à l'aide de tétrodes. L'application de la force mécanique via les filaments de von Frey était associée à une augmentation de l'activité dans toutes les bandes de fréquences par rapport aux niveaux d'activité de base (avant le stimulus) (Fig. 1d, e ; voir également la Fig. 1a supplémentaire). Dans plusieurs essais et animaux, l'augmentation était statistiquement significative de la puissance des oscillations bêta (14–30 Hz) lorsque des stimuli au niveau et au-dessus des seuils nociceptifs étaient appliqués (force de von Frey de 0,6–1,0 g) ainsi qu'avec une faible intensité , des stimuli tactiles non nocifs (0, 07 à 0, 16 g), tandis que la puissance des oscillations gamma (30 à 100 Hz) augmentait de manière sélective avec la stimulation de la force nociceptive (Fig. 1f). Cette découverte est particulièrement intéressante car les oscillations gamma dans les zones corticales ont été fonctionnellement liées à la nociception dans les études sur les humains et les rongeurs8,9,10, et sont connues pour être associées à la synchronisation de l'activité via les interneurones GABAergiques11. L'augmentation induite par la stimulation mécanique nocive de l'activité bêta ainsi que de l'activité gamma a atteint des niveaux statistiquement significatifs avant la réponse nocive comportementale et a été maintenue pendant 2 s après l'application du stimulus (Fig. 1g, à titre de comparaison, les données sur la stimulation non nocive sont montré dans la Fig. 2b supplémentaire).

Nous avons ensuite cherché à tester l'importance potentielle du NBM dans la progression de la nociception vers l'hypersensibilité caractéristique de la douleur inflammatoire persistante. En effet, des souris présentant une inflammation unilatérale de la patte arrière induite par l'injection d'adjuvant complet de Freund (CFA), qui présentent une hypersensibilité nociceptive (Fig. 1c supplémentaire), ont démontré une expression accrue de Fos dans les neurones cholinergiques du NBM (Fig. 2a, b). Nous avons ensuite comparé l'activité oscillatoire entre les conditions naïves et après l'établissement de l'hypersensibilité induite par le CFA. Vingt-quatre heures après l'injection de CFA dans la patte arrière, ce qui correspond au moment où l'hypersensibilité comportementale à la stimulation mécanique atteint un pic dans nos mains, la stimulation de la patte a provoqué une augmentation significativement plus importante de la puissance des rythmes bêta et gamma (Fig. 2c, d ), mais pas d'activité alpha et thêta (Fig. 1d supplémentaire) dans le NBM. Une découverte intéressante était que l'augmentation de la puissance gamma et bêta associée à la douleur inflammatoire était observée avec de faibles intensités de stimulation mécanique, qui sont généralement non nocives dans des conditions physiologiques mais sont perçues comme nocives à l'état enflammé (Fig. 2e). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le NBM est recruté pendant la nociception et montre une facilitation de sa réactivité au cours de la transition vers l'hypersensibilité dans le comportement inflammatoire de type douleur.

a, b Comparaison de l'activité des neurones cholinergiques du NBM en présence ou en l'absence d'application d'une stimulation mécanique avec une force de 0,16 g sur la patte postérieure plantaire controlatérale dans les conditions de base ou 1 jour après l'injection de CFA. Les exemples typiques (a) et la quantification (b) sont illustrés ; n = 4 souris/groupe ; P < 0,05 (*0,0005, #0,0134), ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Sidak. c Représentation temps-fréquence de la puissance spectrale dans le NBM chez la souris au jour 1 après l'injection de CFA (n = 5 souris/traitement). d, e Comparaison de la puissance de l'activité oscillatoire dans les plages de fréquences bêta et gamma entre les conditions naïves (fictives) et le CFA jour 1, calculée en pourcentage d'augmentation de la période post-application de 2 s sur l'activité de base de 1 s avant l'application du stimulus. Les courbes stimulus-réponse (d) ou l'analyse du % de variation de la puissance spectrale (e) en réponse à des filaments inoffensifs (0,07 et 0,16 g) et à une pression mécanique nocive (0,6 à 1,0 g) sont présentées ; n = 5 souris/groupe ; *P < 0,05 (0,0417 pour 0,07 g, 0,0244 pour 0,16 g en d ; 0,0425 pour bêta-faible et 0,0095 pour gamma-faible en e), ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Sidak. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM.

L'analyse de l'activité au niveau de la cellule unique via le tri des pointes a conduit à des informations intéressantes sur la nature cellulaire de la sensibilité et de la plasticité du NBM dans la douleur. Parmi les 221 unités enregistrées dans des conditions naïves, moins de 10 % ont montré une augmentation ou une diminution constante de la cadence de tir dans les essais de retrait lors de l'application de 20 stimulations mécaniques de la patte avec le filament faible ou fort (Fig. 3a, b) ; Des exemples de traces et de scores Z moyens (indiquant le nombre d'écarts types pour les points de données au-dessus ou en dessous de la moyenne) sont illustrés à la Fig. 3a et les proportions unitaires à la Fig. 3b. Chez les souris présentant un comportement inflammatoire de type douleur, la proportion d'unités répondant à la stimulation mécanique n'a pas changé de manière significative lors d'une forte hypersensibilité au cours des 4 premiers jours après l'injection de CFA (Fig. 3b et Supplémentaire Fig. 2a). Au cours de cette période, cependant, les valeurs maximales du score z ont augmenté de manière significative dans les neurones excités par des intensités nocives de stimulation mécanique (Fig. 3c), mais pas dans les neurones inhibés par une stimulation mécanique (Fig. 2b supplémentaire), correspondant ainsi à l'augmentation globale de la puissance d'activité oscillatoire que nous avons observée au niveau du LFP. De plus, en analysant la forme de la forme d'onde de pointe, nous avons ensuite classé les unités en classe 1 (Fig. 3d) et en classe 2 (Fig. 3e) avec des formes d'onde de pointe larges ou étroites, respectivement12 ; les classes à pics rapides de neurones de projection GABAergiques et d'interneurones sont représentées au sein des unités de classe 213. Fait intéressant, seuls les neurones de classe 2 ont montré une augmentation statistiquement significative de l'activité en réponse à la stimulation sensorielle chez les souris présentant une inflammation de la patte par rapport aux souris témoins (Fig. 3d, e). Ces données suggèrent que les neurones NBM, qui sont excités par des stimuli mécaniques, subissent une facilitation lors de la manifestation de l'hypersensibilité nociceptive inflammatoire et, en outre, que les neurones GABAergiques de classe 2 à pic rapide dans le NBM contribuent particulièrement à ces changements. Cette découverte est remarquable, car dans le NBM de souris, 92 % des neurones cholinergiques exprimant la ChAT sont connus pour être GABAergiques14. À des moments tardifs après l'injection de CFA (7 à 14 jours), après la récupération de la sensibilité nociceptive normale, nous avons observé que les schémas d'activité oscillatoire et unicellulaire dans le NBM non seulement se normalisent, mais tombent même en partie en dessous des valeurs de base (Figs. 2b et 3a, b).

a Exemples typiques (panneaux supérieurs) et scores z moyens, qui représentent le nombre d'écarts types pour les points de données au-dessus ou en dessous de la moyenne, démontrant les unités NBM qui sont excitées par une stimulation nocive de la patte (panneau le plus à gauche), les unités qui sont dont l'activité est supprimée par la stimulation de la patte (panneau du milieu) et les unités dont l'activité n'est pas modifiée de manière significative après la stimulation de la patte. b Répartition des unités NBM répondant à la stimulation mécanique dans des conditions naïves (fictives) et pendant le pic de douleur inflammatoire induit par le CFA de la patte arrière (jour 1 à 4). c – e L'amélioration maximale de l'activité par rapport aux valeurs de base moyennes pour les unités excitées par stimulation mécanique est démontrée chez les souris naïves et post-CFA. Dans d, e, les unités sont subdivisées en types de neurones de classe 1 (d) et de classe 2 (pointage rapide; e) en fonction de la forme d'onde. n = 5 souris/groupe ; *P < 0,05 (0,0412 en c ; 0,0191 en e), ANOVA bidirectionnelle avec test de comparaisons multiples de Sidak (c) et test t bilatéral non apparié (d, e). Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM.

Pour découvrir directement l'importance de nos découvertes, nous avons utilisé une approche optogénétique spécifique à la cellule en ciblant le canal cationique dépendant de la lumière bleue Channelrhodopsin vers les neurones exprimant la ChAT. Des virions adéno-associés (AAV) recombinants ont été injectés de manière stéréotaxique pour exprimer la Channelrhodopsine marquée par une protéine fluorescente jaune de manière dépendante de Cre (rAAV-Dio-ChR2-YFP) unilatéralement dans le NBM de souris transgéniques ChAT-Cre (Fig. 4a, b ). Des souris Cre-négatives soumises aux mêmes traitements ont servi de témoins. L'apport de lumière bleue au NBM via des fibres optiques implantées de manière chronique a considérablement augmenté l'expression de Fos dans les neurones cholinergiques, établissant ainsi la validation in vivo de l'approche (Fig. 4c, d). Lors de la stimulation par la lumière bleue, la sensibilité de base aux stimuli mécaniques est restée inchangée (Fig. 4e, ligne de base) ; cependant, le déplacement vers la gauche et vers le haut de la fonction stimulus-réponse de von Frey, représentant la manifestation de l'hypersensibilité inflammatoire, a été significativement réduit chez les souris Cre + par rapport aux témoins Cre- lorsqu'ils ont été testés au pic de sensibilisation le jour 2 post-CFA (Fig. 4e, panneau du milieu). De même, le seuil de retrait mécanique a été significativement augmenté chez les souris avec CFA lors de la stimulation par la lumière bleue chez Cre +, mais pas chez les souris Cre- témoins (Fig. 4f). Dans l'ensemble, l'ampleur de l'hypersensibilité mécanique par rapport aux valeurs de base a diminué et le retour à la sensibilité de base a été plus rapide lors de la stimulation optogénétique des neurones cholinergiques NBM (Fig. 4f). Cependant, l'hyperalgésie thermique induite par le CFA n'a pas été significativement modifiée en amplitude ou en durée (Fig. 4g).

un schéma de manipulation optogénétique des neurones cholinergiques NBM avec une lumière laser bleue. b–d Expression de l'opsine excitatrice, Channelrhodopsin-EYFP dans le NBM (b), exemples typiques (c) et quantification (d) de l'expression améliorée de Fos dans les neurones EYFP+ et ChAT+ (flèches en c) avec la lumière bleue, validant ainsi la efficacité de l'activation optogénétique in vivo. n = 3 souris/groupe ; *P < 0,05 (0,0234, haut ; 0,0183, bas), test t bilatéral non apparié. Barre d'échelle = 200 µm en b et 25 µm en c. e, f Atténuation significative de l'hypersensibilité mécanique maximale (jour 2) induite par l'injection intraplantaire de CFA, illustrée par des courbes stimulus-réponse (e) et des seuils de retrait (f) en réponse à la stimulation de von Frey ; Les valeurs P en encadré représentent une comparaison basée sur l'ANOVA des deux courbes stimulus-réponse entières. g Absence de modulation de l'hypersensibilité à une rampe de chaleur. e, fn = 7 souris ChAT-Cre- et 8 souris ChAT-Cre+ ; P < 0,05 (*0,0275, milieu en e ; *0,0139, #0,0231, milieu en f), ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Sidak. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM.

Étant donné que le NBM se projette sur un grand nombre de cibles néocorticales, dont beaucoup affectent la douleur et l'hypersensibilité de multiples façons, nous avons ensuite cherché à disséquer l'importance des projections neuronales du NBM sur le cortex préfrontal médial (mPFC), qui représente un centre clé du cerveau. circuits sous-jacents à la douleur. Le mPFC subit une plasticité marquée dans plusieurs conditions cliniques de douleur chronique chez l'homme et, en particulier, un accent majeur a émergé sur sa désactivation observée chez certains patients souffrant de douleur chronique15, une découverte qui est également rapportée dans des modèles animaux de douleur neuropathique16,17,18,19. Nous avons donc exprimé ChR2-YFP dans les neurones ChAT du NBM et placé la fibre optique pour l'éclairage par la lumière bleue dans le cortex prélimbique (PL), l'homologue murin du mPFC humain (Fig. 5a). L'activation sélective des projections cholinergiques NBM vers le PL n'a pas influencé la sensibilité mécanique de base, mais a eu un effet analgésique encore plus fort que l'activation directe des neurones NBM sur l'hypersensibilité mécanique induite par le CFA, qui a été complètement inversée aux valeurs de base (Fig. 5b). De plus, l'hypersensibilité thermique a été supprimée de manière significative sur une longue période post-CFA chez les souris avec une stimulation optogénétique des projections NBM-PL (Fig. 5c).

a–c Schéma de stimulation optogénétique des projections NBM-PL cholinergiques-GABAergiques, et son impact sur l'hypersensibilité mécanique inflammatoire (jour 2 ; b) et à la chaleur (c) ; Les valeurs P dans l'encadré (b) représentent une comparaison basée sur l'ANOVA des deux courbes stimulus-réponse entières. n = 6 souris ChAT-Cre- et 11 souris ChAT-Cre+ ; P < 0,05 (* 0,0043, panneau de droite en b ; *, # < 0,0001 pour les jours CFA 3 et 8 en (c)), ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Sidak. d Schéma de connectivité entre les projections NBM cholinergiques-GABAergiques, les afférences excitatrices et divers neurones PL ayant un impact sur le déclenchement des neurones pyramidaux PL via la signalisation cholinergique nicotinique et muscarinique. IN interneurone GABAergique, neurone pyramidal PN ; types d'interneurones GABAergiques : type parvalbumine PV, type somatostatine SOM, type peptide intestinal vasoactif VIP. e Exemple d'images d'immunohistochimie anti-YFP montrant des projections NBM vers le PL (grossissement vers la droite) et les cortex adjacents (à gauche : différents champs confocaux à haute résolution cousus ensemble). Barres d'échelle = 250 µm (à gauche) et 100 µm (à droite). f–h Fos quantification de toutes les couches PL ou couche 5 (f) et dans les neurones de projection excitateurs (SATB2- ou Ctip2 ; g) et les neurones inhibiteurs (PV ou SOM ; h) en réponse à la stimulation optogénétique de NBM-PL cholinergique-GABAergique projections (représentées par des souris Cre+) ou témoins (représentées par des souris Cre-) (toutes les souris sont "Laser ON"). N = 5 souris/groupe pour les panels f–h ; *P < 0,05 (toutes les couches : 0,0091, Sham, <0,0001, CFA ; couche 5 : 0,0036, Sham, <0,0001, CFA), ANOVA bidirectionnelle suivie d'un test de Sidak post hoc pour f et d'un test t bilatéral non apparié pour g (P = 0,0166, pour SATB2 & 0,0066 pour Ctip2) et h. Seules les souris injectées de CFA sont représentées en g, h. i Hypersensibilité mécanique inflammatoire chez des souris Rbp4-Cre exprimant le DREADD excitateur, hm3D(Gq) de manière Cre-dépendante. n = 8 souris/groupe ; *P < 0,05 (0,0019, 0,0019, 0,0002 pour les filaments de 0,07, 0,16 et 0,4 g, respectivement), ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Sidak. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM.

Des études électrophysiologiques et de modélisation indiquent que les entrées cholinergiques du cerveau antérieur basal exercent des effets excitateurs directs via la signalisation médiée par les récepteurs sur les neurones pyramidaux corticaux et ont également la capacité d'évoquer l'inhibition ou la désinhibition des neurones pyramidaux via la signalisation sur différentes classes d'interneurones GABAergiques néocorticaux locaux ou via la signalisation par différents types de récepteurs nicotiniques et muscariniques14,20. Fait intéressant, des études récentes indiquent également que le GABA est co-libéré à partir de projections cholinergiques provenant des noyaux basaux du cerveau antérieur et peut ainsi désinhiber les neurones pyramidaux néocorticaux en supprimant les interneurones inhibiteurs locaux14,21 (schéma de la Fig. 5d). Il a été suggéré que les deux mécanismes agissent pour améliorer le traitement cortical signal-bruit des entrées sensorielles, par exemple, les entrées visuelles dans le cortex visuel et les entrées tactiles dans le cortex somatosensoriel21. Pour déterminer comment les projections cholinergiques-GABAergiques NBM-PL affectent le PL, nous avons effectué un traçage viral et une cartographie c-Fos à travers les couches en conjonction avec l'optogénétique. Fait intéressant, alors que les projections du NBM sur la majeure partie du manteau néocortical couvrent de manière diffuse toutes les couches corticales, nos analyses de traçage ont révélé que les projections du NBM au PL se terminent dans la couche 5 de manière particulièrement abondante par rapport aux autres couches (Fig. 5e ; comparer avec les couches voisines cortex moteur M2 et domaines corticaux cingulaires). Dans les conditions de base (souris naïves) et chez les souris présentant un comportement inflammatoire de type douleur, la stimulation optogénétique des projections NBM-PL a entraîné une augmentation significative des niveaux de Fos dans tout le PL, y compris les couches 2/3, 5 et 6 (Fig. 5f et Fig. 4a supplémentaire ; tous les points de données représentent des conditions "laser activé"). Les neurones PL exprimant Fos ont augmenté lors de l'inflammation de la patte par rapport aux niveaux de base chez toutes les souris ; cependant, l'activation optogénétique des connexions NBM-PL chez les souris exprimant ChR2 a augmenté le nombre de neurones PL exprimant Fos chez les souris injectées par CFA au-delà de l'augmentation induite par l'inflammation (Fig. 5f et Fig. 4a supplémentaire; tous les points de données représentent "laser ACTIVÉ"). Nous avons ensuite effectué une caractérisation détaillée de la nature des neurones Fos + chez des souris injectées de CFA en utilisant un anticorps anti-SATB2 pour marquer les neurones excitateurs qui montrent une préférence relative pour les neurones d'association qui se projettent de manière intra-télencéphalique vers d'autres zones néocorticales22 et un anticorps anti-Ctip2 pour marquer des neurones excitateurs se projetant sous-cortical23, et des anticorps anti-Parvalbumine et anti-Somatostatine pour marquer les deux populations les plus abondantes de neurones GABAergiques11. Nous avons observé que la stimulation optogénétique des projections NBM-PL améliore l'activation de Fos dans les populations SATB2 et Ctip2 de neurones de projection excitateurs (Fig. 5g), mais ne modifie pas l'activité des neurones GABAergiques dans le PL (Fig. 5h). Des études récentes ont montré qu'une sortie clé du PL comprend des neurones pyramidaux de la couche 5 dans le PL qui se projettent vers le gris périaqueducal et se lient ainsi aux systèmes modulateurs nociceptifs descendants24. Nous avons donc stimulé sélectivement les neurones de la couche 5 de manière chimiogénétique en dirigeant viralement l'expression de hM3D (Gq) dans la lignée Rbp4-Cre spécifique à la couche 5 et avons observé que l'amélioration sélective des sorties de la couche 5 dans le PL imite l'action antihyperalgésique de la stimulation NBM-PL sur l'allodynie mécanique chez souris avec CFA, tandis que la sensibilité de base n'a pas été modifiée (Fig. 5i, panneau de gauche; l'expression de mCherry a été utilisée comme contrôle, Fig. 5i, panneau de droite).

Du point de vue de la pertinence translationnelle, il est important de se demander si le ciblage du système cholinergique NBM est également bénéfique dans d'autres formes de douleur, en particulier la douleur neuropathique. Par conséquent, nous avons examiné si le système NBM cholinergique est recruté dans l'état de douleur neuropathique et est lié à l'allodynie mécanique en étudiant l'expression de Fos en l'absence ou lors de l'application plantaire d'une force de von Frey mécanique de faible intensité, qui est inoffensive dans les conditions de base. L'expression de Fos dans le NBM était significativement élevée chez les souris neuropathiques par rapport aux souris blessées de manière fictive et a montré une nouvelle augmentation lors de la stimulation de la patte associée à l'allodynie mécanique (Fig. 6a, b). Il est important de noter que cela s'est également reflété dans les neurones cholinergiques exprimant la ChAT (Fig. 6a, b), ce qui suggère un recrutement accru par des stimuli inoffensifs dans les conditions de base mais perçus comme nocifs dans les conditions de douleur neuropathique, montrant ainsi des parallèles avec nos découvertes dans des expériences électrophysiologiques. dans le modèle de douleur inflammatoire décrit ci-dessus.

a, b Exemples typiques et résumé quantitatif de l'expression du marqueur d'activité Fos dans les neurones cholinergiques (exprimant ChAT) de la NBM chez des souris naïves et des souris atteintes d'une lésion nerveuse de constriction chronique (CCI) en présence ou en l'absence d'une faible intensité ( 0,16 g) stimulus mécanique à la patte arrière controlatérale. Barre d'échelle = 50 µm ; n = 4 souris/groupe ; P < 0,05 (*0,0168, #0,0065), ANOVA bidirectionnelle avec les tests de comparaisons multiples de Sidak. c, d Schéma d'activation chimiogénétique des neurones cholinergiques NBM exprimant hm3D (Gq) avec du N-oxyde de clozapine (CNO; c) et validation de son efficacité pour augmenter l'expression de Fos par rapport aux souris exprimant mCherry dans les neurones cholinergiques (contrôle; d). dn = 3 souris/groupe. Comparaison des réponses nocifensives induites par la capsaïcine (e) et du développement de l'hypersensibilité mécanique (f) ou de l'hypersensibilité thermique (g) induite par la CCI entre les souris avec activation chimiogénétique des neurones cholinergiques NBM et les souris témoins (mCherry). Les valeurs P dans l'encart (f) représentent une comparaison basée sur l'ANOVA des deux courbes stimulus-réponse entières. n = 5 souris factices et 6 souris hM3D(Gq); *P < 0,05 (0,0121 en e ; 0,0178 & 0,0231, CCI jour 7 ; 0,0151 & 0,0165, CCI jour 11 ; 0,0209 CCI jour 28 en f ; <0,0001, CCI jour 4 ; 0,010, CCI jour 14 en g), deux- façon ANOVA avec le test de comparaisons multiples de Sidak. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM.

Pour tester la signification fonctionnelle de ces résultats dans le contexte des douleurs neuropathiques, nous avons utilisé une approche chimiogénétique pour activer les neurones cholinergiques du cerveau antérieur basal, qui offrait deux avantages : premièrement, elle permettait de cibler une zone plus large que la stimulation optogénétique (qui est limitée en raison de la surface maximale pouvant être suffisamment éclairée), et deuxièmement, il a permis d'obtenir une activation plus durable des neurones cholinergiques. Les transgéniques ChAT-Cre ont reçu une injection de rAAV exprimant soit l'actionneur chimiogénétique excitateur (mcherry-tagged hM3D(Gq)) soit la protéine témoin (mCherry) d'une manière dépendante de Cre et traités avec du Clozapine N-Oxide, qui permet l'activation inductible de hM3D( Gq)25 (Fig. 6c). L'immunohistochimie double pour ChAT et Fos a démontré que 77% des neurones cholinergiques du NBM exprimaient hM3D (Gq) et 74% démontraient l'expression de Fos lors du traitement par CNO, tandis que moins de 5% montraient l'expression de Fos en l'absence de CNO (Fig. 6d), validant ainsi l'efficacité et la spécificité de l'activation chimiogénétique des neurones cholinergiques NBM. Conformément aux données des expériences d'optogénétique, nous avons observé que la sensibilité nociceptive de base à la pression mécanique et à la chaleur n'était pas modifiée ; cependant, le comportement de type douleur tonique induit par l'injection plantaire de capsiacine a été réduit de manière significative lors de l'activation chimiogénétique des neurones cholinergiques (Fig. 6e – g).

Nous avons ensuite utilisé le modèle de lésion de constriction chronique (CCI) impliquant une ligature lâche unilatérale du nerf sciatique, entraînant une inflammation et un gonflement locaux du nerf, une neuropathie et une hypersensibilité nociceptive pouvant durer jusqu'à un mois26. L'hypersensibilité mécanique induite par CCI a été nettement réduite chez les souris exprimant hM3D (Gq) par rapport aux souris exprimant mCherry à partir du jour 4 après la chirurgie CCI (Fig. 6f). Au jour 11, les réponses mécaniques chez les souris exprimant hM3D (Gq) étaient indiscernables de la sensibilité de base, tandis que les souris exprimant mCherry continuaient à montrer une hypersensibilité mécanique et ne retrouvaient les valeurs de base qu'au jour 28 (Fig. 6f). De même, l'hypersensibilité à la chaleur a été significativement réduite chez les souris exprimant hM3D (Gq) par rapport aux souris exprimant mCherry jusqu'au jour 14 après la CCI (Fig. 6g). Ces données montrent que l'activation du NBM supprime l'hypersensibilité neuropathique sur une longue durée.

L'activité des neurones NBM a le potentiel d'affecter le traitement de la douleur directement via la signalisation cholinergique dans les cibles néocorticales qui sont importantes dans les réseaux de la douleur, comme indiqué par nos observations ci-dessus sur les neurones de la couche préfrontale 5. Cependant, comme le NBM est connu pour être un modulateur clé des circuits sous-jacents à l'éveil et à l'attention20, il est également possible que les effets antihyperalgésiques observés soient liés à l'attention et à l'attente. Nous avons donc également examiné si la stimulation optogénétique des neurones cholinergiques NBM affecte le comportement d'attention en utilisant le test de tâche de réaction en série à cinq choix largement accepté (5-CSRT; Fig. 7a) dans les mêmes conditions que celles mises en œuvre chez les souris utilisées pour les tests nociceptifs dans les expériences. décrit dans les Fig. 4–6. Pendant 3 semaines, des souris retenues par l'eau ont été entraînées à apprendre des tâches de conditionnement opérant afin de prendre les bonnes décisions pour recevoir une récompense en eau (Fig. 7a). La stimulation chimiogénétique des neurones cholinergiques NBM a considérablement amélioré la précision des réactions et réduit le taux d'omissions, indiquant un niveau d'attention plus élevé (Fig. 7b). Cependant, lorsque nous avons stimulé optogénétiquement les projections NBM-PL dans les mêmes conditions que celles utilisées dans les analyses du comportement de type douleur, il n'y a eu aucun impact significatif sur la précision des réactions et le taux d'omissions (Fig. 7c et Supplémentaire Fig. 5a, b), suggérant que la manifestation d'un comportement antihyperalgésique n'était pas en soi liée à des altérations attentionnelles. Il est cependant plausible qu'une amélioration potentielle de l'attention ait été manquée dans les expériences liées aux projections NBM-PL en raison d'un effet de plafond dans les conditions de base, et la situation peut être différente dans un état douloureux associé à une attention altérée. Nous avons donc testé des souris présentant un comportement ressemblant à une douleur inflammatoire dans le test 5-CSRT et observé que toutes les souris présentaient une augmentation significative du taux d'omission jusqu'à 3 jours après l'AFC par rapport aux conditions de base (Fig. 7d). Cependant, l'activation optogénétique des projections NBM-PL chez ces souris n'a pas sauvé les déficits attentionnels persistants associés à la douleur (Fig. 7d et Supplémentaire Fig. 5c) et la déficience induite par le CFA a été maintenue, que la stimulation laser soit activée (Fig. 7d) ou off (Fig. 5c supplémentaire) chez les souris témoins ChAT-Cre ou Cre-négatives, suggérant ainsi en outre que les projections NBM-PL induisent une analgésie indépendamment de la modulation attentionnelle.

un schéma d'entraînement des souris à des tâches liées à l'attention dans le test de tâche de réaction en série à 5 choix (5-CSRT). b, c Augmentation des paramètres liés à l'attention chez les souris avec activation chimiogénétique des neurones cholinergiques dans le NBM (b), mais pas chez les souris avec activation optogénétique des projections cholinergiques du NBM vers le PL (c). n = 10 souris/groupe (b); n = 6 souris ChAT-Cre- et 8 souris ChAT-Cre+ (c); *P < 0,05 (essais d'omission, 0,0259 ; précision, 0,0008), test t bilatéral apparié. d Altérations du comportement attentionnel lors de l'induction d'un comportement ressemblant à une douleur inflammatoire après injection de CFA dans la patte arrière par rapport au comportement de base en présence d'une stimulation par la lumière bleue des projections cholinergiques NBM-PL chez les souris ChAT-Cre + et les souris Cre- contrôle. N = 9 souris ChAT-Cre- et 10 souris ChAT-Cre+ ; *P < 0,05 (Cre-, 0,0068 ; Cre+, <0,0001), ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Sidak. e–g Analyse du comportement lié à l'anxiété (supérieur en e, f, g) et de la locomotion (inférieur en e, f, g) dans le test en champ libre chez les souris avec activation chimiogénétique (e) ou optogénétique (f) des neurones dans le NBM ou souris avec activation optogénétique des projections cholinergiques du NBM vers le PL (g), par rapport à leurs groupes témoins respectifs. n = 6 souris mCherry et 8 souris hm3D(Gq) (e) ; n = 7 souris ChAT-Cre- et 8 souris ChAT-Cre+ (f); n = 6 souris/groupe (g); *P < 0,05 (0,0182 pour le score d'anxiété en g), ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples de Sidak. Les données sont présentées sous forme de moyenne +/- SEM.

Deuxièmement, le NBM reçoit des entrées directes du CeA et est lié aux circuits neuronaux d'anxiété et de peur27. Nous avons observé que ni la stimulation chimiogénétique directe (Fig. 7e) ni la stimulation optogénétique des neurones NBM (Fig. 7f) n'induisaient de comportements associés à la peur dans le test en champ ouvert (le rapport centre-marge était inchangé). En revanche, les projections NBM-PL stimulantes de manière optogénétique ont réduit le rapport centre-marge chez les souris naïves, suggérant des effets anxiolytiques (Fig. 7g). Enfin, la locomotion était inchangée dans tous les groupes impliquant une modulation optogénétique ou chimiogénétique des circuits NBM ou NBM-PL, suggérant une absence d'effets de confusion sur la fonction motrice dans les analyses comportementales (Fig. 7e – g).

La littérature sur le noyau cholinergique du cerveau antérieur basal et la perception de la douleur est étonnamment rare. À ce jour, moins d'une poignée d'études ont testé l'activité du noyau cholinergique basal du cerveau antérieur lors d'une stimulation nocive28,29. Dans cette étude, nous rapportons maintenant la nature précise des rythmes oscillatoires dans le NBM ainsi qu'une analyse détaillée au niveau d'une seule cellule in vivo, montrant que le NBM répond non seulement aux stimuli nocifs, mais subit également des changements dynamiques au cours de la transition. à un état de type douleur chronique. L'observation la plus intéressante était que la puissance de l'activité oscillatoire gamma dans le NBM est spécifiquement améliorée en conjonction avec une stimulation nocive avant la réponse comportementale. Les oscillations gamma dans le S1 ont été fonctionnellement liées à la modulation nociceptive dans les systèmes humain et rongeur in vivo30,31, et ces altérations de l'activité gamma liées à la douleur n'ont été étendues que récemment à d'autres néocortex, tels que les cortex préfrontal et insulaire9,32 ,33. Cette étude, à notre connaissance, représente le premier rapport reliant les rythmes gamma dans une structure sous-corticale à la sensibilité nociceptive. Ceux-ci ont probablement été manqués dans les études humaines en raison des limitations techniques des enregistrements du cuir chevelu.

Il est important de noter que notre observation selon laquelle, dans un modèle de douleur inflammatoire, la puissance de l'activité gamma est potentialisée en réponse à une stimulation tactile non nocive est en corrélation avec la manifestation de l'allodynie mécanique et imite des observations similaires faites dans le cortex S131. Pris ensemble avec les connaissances actuelles, une implication alléchante de nos découvertes est que l'activité gamma dans le NBM est fonctionnellement liée via des voies cholinergiques aux oscillations gamma néocorticales pendant le traitement nociceptif. Ceci est étayé par plusieurs points conceptuels et observations expérimentales. Premièrement, une étude récente chez des rats a rapporté des changements hémodynamiques du flux sanguin dans le NBM suite à une stimulation nocive et a démontré que les changements du flux sanguin cérébral dans le cortex S1 ipsilatéral évoqués par une stimulation nocive étaient significativement réduits lors de la lésion du NBM34, suggérant ainsi l'importance du NBM dans le manifestation complète des réponses liées à la douleur dans le cortex somatosensoriel. Deuxièmement, à la fois dans S1 et dans le cortex préfrontal, la signalisation cholinergique facilite ou même suscite directement l'activité oscillatoire de la bande gamma via la modulation des interneurones GABAergiques locaux35,36, améliorant ainsi l'acuité du traitement des stimuli dans les réseaux sensoriels et attentionnels, bien que ces phénomènes n'aient pas été abordée dans le contexte de la douleur jusqu'à présent. De plus, l'activité oscillatoire gamma a été proposée pour coordonner et relier les états d'activité sur des sites distants du cerveau, ce qui est un concept particulièrement remarquable dans le contexte de la douleur8, puisque la douleur est essentiellement une fonction de réseau37,38.

Un rôle prépondérant dans l'émergence de l'activité oscillatoire gamma est attribué aux interneurones GABAergiques à pics rapides, qui sont largement interconnectés via des jonctions lacunaires ; ils rationalisent et synchronisent non seulement la sortie excitatrice dans une région, mais sont également capables de le faire sur des sites distants via des projections GABAergiques à longue portée, qui se synapsent généralement sur les neurones GABAergiques, entraînant ainsi une désinhibition8,11. Fait important, ici, nous avons observé que, alors que différents ensembles de neurones NBM montraient une excitation ou une inhibition lors de la stimulation nociceptive, les neurones NBM subissant des changements significatifs lors de la transition vers l'hypersensibilité nociceptive étaient dérivés de l'analyse de la forme d'onde pour être des neurones GABAergiques à pointe rapide. Dans le NBM, une majorité écrasante de neurones cholinergiques sont GABAergiques11 et ceux-ci comprennent des projections à longue portée vers le manteau néocortical, fournissant ainsi une crédibilité supplémentaire à l'association entre les origines de l'activité oscillatoire gamma dans le NBM et la modulation corticale de la douleur. Nous avons également observé des changements dans la gamme de fréquences bêta de l'activité oscillatoire ; cependant, on en sait beaucoup moins sur ses origines cellulaires et son importance fonctionnelle pour la douleur. Des études chez des sujets sains ont rapporté que l'activité dans les bandes de basse fréquence, en particulier dans les gammes alpha et bêta, est supprimée dans les cortex S1, préfrontal et insulaire en corrélation avec les évaluations subjectives de la douleur9,39. Des travaux supplémentaires seront nécessaires pour démêler l'importance des changements de rythme bêta dans le NBM dans les états de douleur et si et comment cela contribue aux changements des oscillations bêta dans le néocortex.

Nos analyses avec le produit génique précoce immédiat induit par l'activité, Fos, suggèrent que les neurones cholinergiques du NBM sont de plus en plus recrutés dans les états douloureux inflammatoires et neuropathiques, en particulier en conjonction avec une stimulation sensorielle. Cette découverte ainsi que le profil fonctionnel global des neurones cholinergiques NBM discutés ci-dessus pourraient également plaider en faveur d'un rôle pour le NBM dans la modulation pro-nociceptive ou antinociceptive. Ici, deux modes indépendants d'activation des neurones cholinergiques NBM ont révélé que le résultat net de leur activation est de supprimer l'hypersensibilité nociceptive. Une étude précédente sur les dommages à grande échelle des neurones cholinergiques utilisant de la saporine conjuguée administrée par injections intracérébroventriculaires a rapporté une réduction de l'échappement volontaire de la chaleur nocive ainsi que du son stressant sans changements dans les comportements nocifs spinaux, concluant que les comportements affectifs, mais pas sensoriels, sont modulés par les neurones cholinergiques du cerveau antérieur40 ; cependant, ces conclusions étaient basées sur une ablation généralisée dans le cerveau, une toxicité parenchymateuse et une perte de connectivité dans un grand nombre de zones, notamment l'hippocampe, l'amygdale et le cortex. Ici, des manipulations spécifiques aux cellules et réversibles de l'activité, plutôt que de l'intégrité neuronale, qui étaient limitées au NBM suggèrent que le recrutement des neurones cholinergiques du NBM joue un rôle protecteur global dans la limitation de la douleur perçue. Étant donné que les neurones NBM projettent vers divers domaines néocorticaux avec des fonctions différentes ainsi que vers l'amygdale, il ne peut être exclu que des connexions individuelles puissent jouer des rôles différents. Dans ce sens, une étude récente portant sur un noyau cholinergique différent, à savoir le noyau septal médial, a rapporté que l'inhibition ainsi que l'activation conduisaient paradoxalement à la suppression du comportement douloureux en opposant des effets sur le cortex cingulaire antérieur rostral et l'hippocampe ventral CA1. région41. Ici, l'activation spécifique des projections NBM sur le cortex PL a constitué un argument sans équivoque pour une fonction antinociceptive, qui s'est accompagnée des observations d'un ciblage plus dense des projections afférentes à la couche 5 et d'une expression accrue de Fos dans les neurones pyramidaux de la couche 5 du PL. Comme support supplémentaire, nous fournissons des preuves que l'amélioration de la sortie des neurones PL de la couche 5 via une stimulation optogénétique a un résultat antinociceptif similaire à la stimulation des connexions NBM-PL. Nos données indiquent que le PL montre une activité accrue dans un état semblable à la douleur inflammatoire, ce qui est cohérent avec une activité oscillatoire accrue dans le NBM dans la douleur inflammatoire. Fait important, l'activité des neurones excitateurs PL, mais pas des neurones inhibiteurs, est encore renforcée par l'activation de la voie NBM-PL. Cette propriété peut avoir une pertinence clinique, puisque la désactivation de la PL a été rapportée chez certains types de patients souffrant de douleur chronique15,19 ainsi que dans des modèles de douleur neuropathique chez les rongeurs16,17,18,19. Dans les modèles de douleur neuropathique, il a été démontré que l'amélioration de la production de PL, soit par optogénétique24,42, pharmacologiquement43 ou via une stimulation cérébrale transcrânienne non invasive44, provoque une analgésie. En effet, les mécanismes sous-jacents à la désactivation du cortex préfrontal dans la douleur chronique sont un sujet d'intérêt actuel intense, avec des études démontrant une inhibition anticipative accrue via la potentialisation des entrées amygdaliennes sur les neurones GABAergiques à pic rapide dans la douleur neuropathique17,24. En revanche, les afférences cholinergiques entrantes du NBM, qui sont connues pour co-libérer le GABA, ont la capacité d'inhiber ou de désinhiber les neurones pyramidaux néocorticaux via une modulation directe par rapport à la modulation des neurones GABAergiques locaux, respectivement. Nos résultats montrent maintenant que les projections cholinergiques-GABAergiques du NBM vers le PL servent à améliorer l'activité du PL via une activation accrue des neurones de projection excitateurs, ce qui pourrait aider à contrer la désactivation du PL dans les états de douleur neuropathique. À l'appui, il existe des preuves d'une étude ex vivo montrant une réduction de l'expression synaptique des récepteurs muscariniques M1 excitateurs dans les neurones de la couche 5 du PL chez des souris neuropathiques45 et une étude rapportant la suppression de l'allodynie neuropathique lors de l'application d'un agoniste M1-M4 dans la partie antérieure cortex cingulaire46. Il sera intéressant dans les études futures de disséquer les contributions relatives du GABA et de l'acétylcholine, qui sont co-libérés des afférences NBM-PL, dans la modulation de l'activité du PL, par exemple, via la livraison régionale d'agonistes et d'antagonistes pharmacologiques.

Étant donné que le MNB remplit diverses fonctions différentes, il est important de tempérer nos inférences avec des interprétations alternatives. La modulation de l'attention est l'une des fonctions les mieux étudiées du NBM20, ce qui a en effet été confirmé dans cette étude chez des souris recevant une stimulation optogénétique directe des somates neuronales cholinergiques du NBM. L'attention a été suggérée pour moduler profondément la perception de la douleur, par exemple en modifiant la modulation descendante ou en termes d'amélioration de la perception de la douleur par hypervigilanz47,48, rendant possible que les facteurs attentionnels jouent un rôle dans la modulation de la douleur par le NBM. Cependant, l'activation sélective des projections cholinergiques NBM au PL était insuffisante pour moduler l'attention et la motivation, et est donc peu susceptible de tenir pleinement compte des changements dans le comportement nocifensif. Au lieu de cela, l'activation accrue des neurones PL de la couche 5 par l'entrée afférente NBM cholinergique-GABAergique rendrait plus plausible que la connectivité directe connue des neurones pyramidaux de la couche 5 au PAG conduit à une modulation descendante de la nociception. L'activité motrice ou l'activité globale étaient inchangées, suggérant que les effets analgésiques observés étaient indépendants de l'éveil et du dysfonctionnement moteur. Les effets anxiolytiques potentiels observés lors de la stimulation des projections NBM-PL sont intéressants, car ils peuvent être particulièrement prometteurs pour traiter la peur en tant que comorbidité de la douleur pathologique49.

Au total, les résultats de cette étude appuient une enquête plus approfondie sur l'utilisation de la modulation cholinergique dans le traitement de la douleur. Bien qu'il ait été démontré que les médicaments ciblant les récepteurs cholinergiques montrent une efficacité dans les modèles précliniques, la large gamme d'effets secondaires entrave l'application clinique. Les inhibiteurs de l'acétylcholine estérase, tels que la rivastigmine et la néostigmine, qui améliorent la biodisponibilité de ce neurotransmetteur aux sites où il est physiologiquement libéré, ont montré une efficacité clinique dans un certain nombre d'études sur la douleur3,50. Il est donc impératif de délimiter les lieux d'action ainsi que les altérations des circuits de la douleur chronique qui sont les plus prometteuses en termes d'effets bénéfiques tout en produisant moins d'effets secondaires. En utilisant une électrophysiologie in vivo de pointe et des manipulations de circuits spécifiques, cette étude démontre que le NBM est un modulateur important des circuits impliqués dans la perception de la douleur et qu'il améliore directement l'activité du NBM ou ses projections sur le PFC, par exemple via de nouvelles conceptions dans les techniques de neurostimulation, est prometteur dans le traitement des troubles douloureux inflammatoires et neuropathiques. Dans ce sens, il est à noter que les NBM ont déjà été impliqués comme site d'action potentiel des anesthésiques généraux51.

Cibler le NBM peut également être prometteur sur le plan thérapeutique dans le contexte d'autres aspects de la douleur chronique qui n'ont pas été abordés dans cette étude. Par exemple, les états de douleur chronique sont fréquemment accompagnés de troubles du sommeil, qui sont pathogènes en aggravant leur pronostic et leur réponse au traitement52,53. Il a été démontré que la privation de sommeil entraîne une réduction de la connectivité du NBM au cortex préfrontal54. De plus, une perte neuronale dans le NBM a été rapportée dans des troubles tels que la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson, et au cours du vieillissement55,56,57,58. Les résultats de cette étude suggèrent que la déplétion neuronale dans le NBM entraînera probablement une perte des effets modulateurs antinociceptifs centraux, contribuant ainsi aux troubles de la douleur fréquemment associés à ces états. Notre observation de la réduction de l'activité NBM à des stades très avancés après l'inflammation de la patte est également intéressante à cet égard. Le développement et les tests en cours de la stimulation cérébrale profonde du NBM56,58 sont donc prometteurs non seulement pour réduire le déclin cognitif, mais également pour supprimer la douleur et rétablir un sommeil normal dans ces troubles.

Des expériences ont été réalisées chez des souris Chat-IRES-Cre hétérozygotes mâles et femelles âgées de 2 à 8 mois (B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl//Uhg59;) avec un fond C57BL/6, et appelées ici ChAT-Cre souris. Des compagnons de litière Cre-(négatifs) ont été utilisés pour des expériences de contrôle. Des animaux Rbp4-Cre mâles et femelles âgés de deux à quatre mois (B6.FVB/CD1-Tg(Rbp4cre)KL100Gsat/Uhg) avec un fond C57BL/6 ont été utilisés pour le ciblage chimiogénétique des neurones pyramidaux de la couche 5 dans le cortex prélimbique. Des animaux mâles et femelles C57BL/6J âgés de 8 à 20 semaines ont été achetés chez Janvier Labs. Les animaux ont été logés avec de la nourriture et de l'eau à volonté sur un cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité. Les directives ARRIVE ont été suivies. Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives éthiques établies par l'organe directeur local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Allemagne ; numéros d'approbation 35-9185.81/G44/17 et 35-9185.81/G184/18).

Les souris ont été profondément anesthésiées par injection intrapéritonéale de fentanyl (0,01 mg/kg), de chlorhydrate de médétomidine (0,3 mg/kg), de midazolam (4 mg/kg). De la lidocaïne (10 %) a été appliquée à la surface de la peau et un petit trou a été percé au-dessus de la région d'intérêt. La livraison in vivo du virus adéno-associé recombinant (rAAV) a été réalisée par des injections stéréotaxiques. Les coordonnées NBM utilisées par rapport au bregma étaient postérieures de 0, 35 mm, latérales de 1, 6 mm, à une profondeur de 4, 55 mm de la pia. Le virus rAAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (University of North Carolina Vector Core, USA) (250 nl) a été administré en 20 min non dilué alors que rAAV5-Syn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry et rAAV5-Syn Les solutions virales -DIO-mCherry (Addgene Inc., USA) ont été diluées à 1:1 dans du PBS et 400 nl ont été injectés en 20 min. Les animaux ont été gardés pendant au moins 3 semaines pour obtenir une expression virale in vivo optimale avant les expériences comportementales et électrophysiologiques.

Pour les expériences optogénétiques, un implant de fibre optique chronique (diamètre de noyau de 200 µm, ouverture numérique (NA) de 0,5) a été inséré à 100 µm au-dessus du site de l'injection virale dans le NBM, ou bilatéralement dans le cortex PL en utilisant une rotation latérale de 15 ° (1,94 mm antérieur du bregma, 0,9 mm latéral, à une profondeur de 1,5 mm de la pie), et fixé sur le crâne avec du ciment dentaire et une vis. L'anesthésie générale a été antagonisée avec des doses intrapéritonéales de naloxone (Inresa Arzneimittel, Fribourg, Allemagne ; 0,4 mg/kg), de flumazénil (Fresenius, Bad Homburg, Allemagne ; 0,5 mg/kg) et d'atipamézole (Prodivet Pharmaceuticals, Belgique ; 2,5 mg/kg) .

Pour les expériences électrophysiologiques, deux vis en acier inoxydable ont été implantées sur le crâne au-dessus du cervelet et du cortex sensoriel droit pour servir respectivement d'électrodes de masse et de référence. Une fenêtre crânienne a ensuite été préparée au-dessus du cerveau antérieur basal gauche (AP = -0,35 mm, ML = 0,9 mm). La dure-mère a été retirée et versadrive-4 (Neuralynx), composé de quatre tétrodes pouvant être entraînées indépendamment (Tungsten, 12 μm de diamètre, California Fine Wire), a été implanté dans le prosencéphale basal gauche à une profondeur initiale de 4,3 mm. La fenêtre crânienne a été recouverte de cire osseuse et la configuration versadrive-4 fixée au crâne avec du ciment dentaire.

Pour la lésion de constriction chronique (CCI26), les souris ont été placées sous anesthésie à l'isoflurane (2%) et la fourrure de la cuisse droite a été rasée. Une incision a été pratiquée sur la surface cutanée latérale de la cuisse et à travers le muscle biceps fémoral pour exposer le nerf sciatique juste au-dessus de celui-ci se ramifiant en nerfs sural, péronier commun et tibial. Quatre ligatures lâches ont été placées autour du nerf sciatique à l'aide de sutures chirurgicales en intestin de chat, le muscle et la peau ont ensuite été suturés à proximité, et les animaux ont été laissés récupérer dans une cage chauffée pendant 24 h. Les tests comportementaux ont commencé à partir du jour 2 après l'opération. La même chirurgie a été réalisée sans placer les ligatures du nerf sciatique sur des animaux témoins fictifs.

Les souris ont été retenues en toute sécurité dans un tissu de coton doux afin de fixer les câbles de raccordement optique (fibres doubles 0,5 NA connectées à un joint rotatif à fibre optique à division de longueur d'onde 1 × 2, Doric Lenses Inc., Canada) aux implants de fibre optique. Le joint rotatif à fibre optique a à son tour été couplé via un cordon de raccordement optique (diamètre de noyau de 200 µm, Thorlabs GmbH) à un laser de 473 nm (Shanghai Laser & Optics Century Co. Ltd, Chine). L'intensité du laser a été fixée à 4 mW, mesurée à l'extrémité de la fibre avec un photomètre (PM100D, Thorlabs). La lumière laser pulsée (20 Hz, durée d'impulsion de 10 ms) était généralement appliquée pendant une durée de 30 s, en commençant 15 à 20 s avant les événements de stimulation mécanique ou thermique, ou avec chaque événement d'initiation de l'essai dans le test 5-CSRT, en utilisant un générateur d'impulsions (réf. 33220 A, Meilhaus Electronic GmbH, Allemagne).

Des tests comportementaux ont été réalisés pendant le cycle lumineux des animaux. Les animaux ont subi deux séances d'acclimatation dans les chambres d'installation utilisées pour tester la sensibilité mécanique ou thermique. La sensibilité de base a été évaluée sur plusieurs jours lors de trois séances de test avant de procéder à des chirurgies CCI ou d'induire une inflammation de la patte via une injection plantaire sous-cutanée de 25 μl d'adjuvant complet de Freund (CFA, Sigma-Aldrich) sous brève anesthésie à l'isoflurane. Des tests comportementaux impliquant des animaux exprimant hM3D(Gq) et des témoins mCherry correspondants ont été effectués 1 h après l'injection de solution saline ou de N-oxyde de clozapine (CNO, injection intrapéritonéale de 2 mg/kg ; Biomol, Allemagne). Les expérimentateurs ont toujours été aveuglés à l'identité des groupes de traitement.

La capsaïcine (Sigma) a été diluée à partir d'une solution mère de diméthylsulfoxyde (DMSO, Thermo Fisher Scientific) congelée (50X) avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, Thermo Fisher Scientific) pour obtenir une concentration de capsaïcine de 0,02 % (poids/vol) dans 2 %DMSO. Les animaux ont été brièvement anesthésiés avec de l'isoflurane à 2 % (Baxter, Allemagne) et 20 µL de la solution de capsaïcine ont été injectés avec une aiguille de 30 G par voie sous-cutanée dans la surface plantaire de la patte arrière. Les animaux ont ensuite été placés dans une boîte transparente (20 × 20 cm) sur une plaque de verre acrylique, et le temps total pendant lequel l'animal a manifesté un comportement nocifatif (levage de patte, léchage, tressaillement, contorsion) a été évalué sur une période de 5 min par un expérimentateur. aveuglé à la condition de traitement.

Après acclimatation à la configuration von Frey (Ugo Basile Inc., Italie), un ensemble de monofilaments qui se plient à des forces de 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g, 0,6 g, 1,0 g et 1,4 g ont été appliqués perpendiculairement sur la surface plantaire de la patte arrière. Cinq applications par filament ont été appliquées avec un intervalle minimum de 1 min entre chaque application. Dans les expériences de stimulation optogénétique, le laser était allumé 20 s avant l'application du filament et éteint 10 s après l'application du stimulus mécanique. Au total, cinq applications par filament et par état laser ont été appliquées lors d'une séance de test pour chaque animal. Les essais ont été notés positifs si l'animal présentait des comportements de réponse nocifs, y compris le retrait rapide de la patte, le léchage ou le tremblement de la patte, soit pendant la stimulation mécanique, soit immédiatement après le retrait du filament. Le seuil de retrait de la patte a été déterminé à l'aide de la méthode up-down de Dixon60.

La configuration de test plantaire Hargreaves (Ugo Basile Inc., Italie) avec une source de chaleur infrarouge (modèle 37370-001, Ugo Basile) a été utilisée pour tester les seuils de retrait thermique en appliquant une chaleur radiante à la surface plantaire de la patte arrière. Le niveau d'intensité a été fixé à 25 et le temps de coupure à 30 s. Un stimulus thermique a été appliqué uniquement pendant la phase d'éveil et la latence de retrait à partir du début du stimulus a été enregistrée. Six essais ont été effectués par condition de traitement et par animal le jour du test, en utilisant un intervalle minimum entre les essais de 2 min. Les essais laser ON ont été aléatoirement entrecoupés d'essais laser OFF au cours d'une session de test optogénétique de Hargreaves. Le laser a été allumé 20 s avant le déclenchement du stimulus thermique et éteint 5 s après une réponse de retrait de la patte.

Le test en plein champ a été réalisé dans une boîte carrée (40 × 40 cm, 38 cm de hauteur) avec une caméra USB fixée au-dessus de la boîte afin de suivre les mouvements des animaux et d'enregistrer les paramètres expérimentaux à l'aide du logiciel ANY-maze (Stoelting Co. , Irlande). Les animaux n'étaient pas acclimatés à cette configuration de sorte qu'ils rencontraient une nouvelle arène à explorer. La boîte a été divisée en trois zones pour l'analyse. Une bordure de 3 cm de large le long des parois de la boîte a été définie comme la zone thigmotaxique. Une zone carrée de 20 × 20 cm au centre géométrique de la boîte a été définie comme zone centrale. La zone restante a été définie comme la zone marginale. Chaque souris a été placée au centre de la boîte et autorisée à explorer librement tout le champ pendant une période de 8 minutes. Le test de 8 min a été divisé en périodes de 30 s avec le laser allumé et éteint alternativement de manière aléatoire afin que chaque souris reçoive un éclairage global de 4 min. Pendant le test, les paramètres de locomotion (distance et vitesse moyenne) au sein de chaque segment ont été enregistrés. Le rapport du temps passé au centre par rapport aux zones thigmotaxiques a été utilisé pour évaluer le comportement de type anxieux. La fonction motrice a été évaluée à partir de la distance totale parcourue dans les trois zones.

Trois cohortes de souris ChAT-Cre exprimant soit la hM3(Gq) DRADD (n = 10) soit l'opsine ChR2(H134R) (n = 8 et n = 10) dans les neurones NBM cholinergiques ainsi que six et neuf témoins Cre-ve les animaux des groupes de test optogénétique ont été formés à la tâche de temps de réaction en série à 5 choix (5-CSRT) à l'aide de chambres opérantes automatisées à écran tactile Bussey-Saksida Mouse (Campden Instruments, Loughborough, Royaume-Uni) et du logiciel ABET II TOUCH (Lafayette Instrument, IN , ETATS-UNIS). Tout au long des étapes de formation et de test, les animaux avaient un accès limité à l'eau potable (30 minutes par jour) et, par conséquent, l'eau pouvait être utilisée comme récompense pour renforcer le comportement de choix correct dans les essais individuels au cours de la tâche. Pour l'accoutumance et l'entraînement, les procédures décrites dans Humby61 et le module de tâches ABET II TOUCH 5-CSRT (version 3) ont été suivies. En bref, un signal lumineux a été présenté dans l'une des cinq fenêtres pendant une période de temps donnée et un essai a été compté comme correct si l'animal a touché le moniteur de la fenêtre indicée dans un délai prolongé de 5 s après la disparition du signal. Si la souris a interagi avec une autre fenêtre (essai incorrect) ou si aucune interaction avec l'écran tactile n'a été détectée (essai d'omission) après la présentation du signal, une période de temporisation punitive a été signalée par l'allumage de la lumière de la maison pendant 5 s. Une session consistait en 60 essais et les souris effectuaient une session par jour. La durée de la cue a été successivement réduite de 30 s à 1,4 s jusqu'à ce que la performance à chaque étape atteigne un critère de précision > 80 % [nombre d'essais corrects/nombre total d'essais répondus (correct + incorrect)] et < 20 % d'omissions [nombre d'essais manqués essais/nombre d'essais présentés] pendant deux jours consécutifs. Les animaux DREADD ont été testés trois fois sur une période de 5 jours en utilisant une durée de signal de 1,2 s après avoir reçu une injection de solution saline ou de CNO. La période de présentation du signal a été augmentée de 0,2 s lors des sessions de maintenance entre les jours de test.

Des cordons de raccordement optiques ont déjà été connectés quotidiennement pendant la dernière phase de formation de la cohorte optogénétique sans allumer le laser. Après avoir atteint le critère de performance avec des signaux affichés pendant 1,8 s, les animaux ont été testés en utilisant une période de présentation des signaux de 1,6 s avec le laser allumé au début de chaque essai et éteint après la collecte de la récompense en eau, ou immédiatement après les 5 s prolongés. fenêtre de temps si aucune réponse tactile correcte n'a été détectée. Après avoir établi une ligne de base en testant avec ou sans le laser allumé, une cohorte de souris ChAT-Cre+ (n = 10) et Cre− (n = 9) a reçu une injection plantaire sous-cutanée de 20 μl CFA (voir la section test comportemental ci-dessus ), et ont ensuite été testés un jour sur deux avec le laser allumé ou éteint, dans un ordre semi-aléatoire. Les animaux qui avaient plus de 30 % d'essais d'omission au cours de la période de référence ont été exclus.

À la fin de l'expérience, les souris ont été tuées avec une surdose de dioxyde de carbone et perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie de formol à 10 % (Merck, Allemagne). Les cerveaux ont été prélevés et post-fixés en plus pendant 24 h à 4 ° C. Des coupes de cerveau ont été coupées avec un vibratome à 50 µm d'épaisseur, montées avec du Mowiol et imagées avec un microscope à fluorescence pour confirmer l'emplacement des sites d'électrodes ou l'injection d'AAV chez les animaux Cre+.

Pour évaluer les changements d'activité des neurones cholinergiques dans des conditions aiguës et inflammatoires de type douleur, les animaux ont été perfusés 90 min après une injection de capsaïcine dans la patte arrière, une stimulation mécanique répétitive (filament de 0,16 g, intervalle de 20 s sur une période de 10 min) de la patte enflammée le jour CFA 2 et le jour 4 à la patte ipsilatérale des animaux CCI et fictifs. Pour évaluer l'activité neuronale induite par la stimulation optogénétique, la lumière laser pulsée a été allumée cinq fois pendant 30 s pendant une période de 10 min chez les animaux Cre + et Cre- qui ont ensuite été perfusés 90 min plus tard. De même, du CNO ou une solution saline a été injecté chez les animaux DREADD 2 h avant la perfusion.

Un double immunomarquage avec anti-Fos (lapin ; ab190289, Abcam, Royaume-Uni) et anti-ChAT (chèvre ; AB144P, Merck) a été utilisé à 1:1000 et 1:250, respectivement. En bref, les sections ont été incubées dans du PBS/glycine 50 mM pendant 10 min, suivies d'une étape de blocage de 60 min dans du sérum de cheval à 4 % avec du Triton à 0,2 % dans du PBS. Les coupes ont été incubées avec les deux anticorps primaires dans la solution de blocage pendant 24 h à 4 °C. Les sections ont ensuite été lavées dans une solution de blocage (trois lavages de 10 min) et incubées avec un mélange d'anticorps secondaires d'âne anti-lapin-Alexa-488 et d'âne anti-chèvre-Alexa-633 (Invitrogen, USA ; 1:700 chacun) dans solution de blocage pendant 2 h à température ambiante. Donkey anti-lapin-Alexa-594 a été utilisé pour les cerveaux avec l'expression de l'EYFP induite par l'AAV. Pour améliorer la fluorescence EYFP des terminaux NBM transduits par AAV, un sous-ensemble de sections de cerveau frontal a été immunomarqué avec un cocktail d'anti-Fos de lapin (1: 1000) et d'anti-GFP de poulet (ab13970, Abcam; 1: 1000, pré-incubé d'abord pour 72 h à 4 °C à une dilution de 1:100 avec des coupes de cerveau de souris naïves C57bl6) anticorps primaires (incubation de 48 h à 4 °C), en utilisant l'âne anti-lapin-Alexa-594 et la chèvre anti-poulet-Alexa-488 (Invitrogen, USA; 1:700 chacun) anticorps secondaires (comme ci-dessus, incubés pendant 2 h à température ambiante). Les tissus ont été lavés deux fois dans du PBS, incubés dans du Hoechst 33342 (dilué à 1:10 000 dans du PBS à partir d'une solution mère à 10 mg/ml, Invitrogen) pendant 10 min, lavés à nouveau dans du PBS, puis incubés pendant 10 min dans du TRIS-HCl 10 mM avant montage.

De plus, deux séries d'expériences de triple marquage immunohistochimique ont été réalisées avec de l'anti-Fos de lapin (Abcam, 1:1000), de l'anti-somatostatine de rat (EMD Millipore, 1:300) et de l'anti-parvalbumine de cobaye (Swant, 1:500 ), ou lapin anti-Fos (Abcam, 1:1000), rat anti-Ctip2 (Abcam, 1:500) et cobaye anti-SATB2 (Synaptic Systems, 1:200). Les sections ont été traitées comme décrit ci-dessus pour la procédure d'immunocoloration double et incubées pendant 48 h à 4 ° C. Les anticorps secondaires utilisés étaient l'IgG d'âne anti-lapin Alexa-488, l'IgG d'âne anti-rat Alexa-594 et l'IgG de chèvre anti-cobaye Alexa 647 (tous Invitrogen, 1:700). La spécificité de la coloration des anticorps a été testée en omettant les anticorps primaires.

Les coupes ont été imagées à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (Leica TCS SP8, Allemagne) avec une résolution de pixels de 1024 × 1024. Les paramètres d'éclairage ont été conservés de manière identique pour une série d'images pour tous les animaux. Un objectif à air sec (Leica, 10×/0,40, HC PL APO) a été utilisé pour l'imagerie des coupes marquées au Fos et un objectif à immersion avec bague de correction (Leica, 20×/0,75, HC PL APO) pour l'imagerie des coupes triplement marquées. Un montage de piles d'images confocales a été acquis sur une profondeur de 25 µm centré sur la région d'intérêt au niveau moyen de chaque section et la projection z maximale des images a été appliquée pour le comptage dans le logiciel ImageJ (version 1.50b, National Institutes de la santé, États-Unis). L'atlas stéréotaxique du cerveau de souris62 et l'atlas de référence de l'Institut Allan (2011) ont été respectivement utilisés pour définir la région d'intérêt et les contours de la couche corticale selon les sections de référence correspondantes. Les cellules marquées au Fos, doubles et triples dans chaque région d'intérêt ont été comptées manuellement en utilisant les mêmes paramètres de contraste et de seuil pour toutes les sections d'un groupe expérimental. Les cellules positives se trouvant sur la frontière ont été exclues. Le nombre de cellules a été converti pour indiquer le nombre de cellules positives dans le volume de la pile imagée dans la région d'intérêt (cellules/mm3).

Une région d'intérêt (1, 5 mm médiolatéral × 1, 0 mm dorso-ventral) a été utilisée comme cadre de comptage au-dessus de la région NBM avec l'expression la plus élevée de neurones ChAT + ou EYFP +. Le bord inférieur du globus pallidus a été utilisé comme limite supérieure. Les cellules Fos + doubles et triples marquées dans le cadre de comptage dans les deux hémisphères ont été comptées manuellement en utilisant les mêmes paramètres de contraste et de seuil pour toutes les sections d'un groupe expérimental. Les comptages de neurones Fos+ doublement marqués du groupe de traitement à la capsaïcine sont des moyennes de trois sections de cerveau exprimées en % de neurones ChAT+ dans chaque hémisphère. Comme le nombre de neurones Fos+ doublement et triplement marqués ne différait pas significativement entre les hémisphères pour tous les autres groupes de traitement, les données des deux hémisphères ont été moyennées pour chaque tranche de cerveau et converties pour indiquer le nombre de cellules positives dans le volume de pile imagé dans la région d'intérêt (cellules/mm3).

Après une semaine de récupération après la chirurgie d'implantation, les tétrodes ont été abaissées de 0,5 mm en moyenne dans la région d'intérêt et sont restées inchangées jusqu'à la fin de l'expérience. Les souris ont eu 2 jours pour s'habituer à la grille surélevée de la configuration d'enregistrement du test de von Frey. Des tests de sensibilité mécanique naïfs ont été réalisés avec des filaments faibles (0,07 g et 0,6 g) et forts (0,6 g et 1,0 g) pendant 4 jours. Chaque filament a été appliqué dix fois sur la surface du planteur de la patte arrière droite avec un intervalle minimal de 60 s entre les essais de stimulation. L'inflammation chronique a été induite en injectant une solution de CFA (25 μl, Complete Freund's Adjuvant, Sigma) par voie sous-cutanée sur le côté plantaire de la patte arrière droite. Des tests de nociception mécanique ont été effectués les jours 1, 2, 3, 4, 7, 9, 12, 14 après l'injection de CFA avec les mêmes filaments utilisés pour les tests de base. À la fin des expériences comportementales, les souris ont été profondément anesthésiées avec 2 % d'isoflurane, l'emplacement de chaque pointe de tétrode marqué en appliquant un courant électrique pour induire une petite lésion, et les animaux ont été perfusés par voie transcardiaque pour fixer le tissu cérébral.

Les signaux neuronaux ont été acquis via un headstage HS-18-MM à l'aide du système Digital Lynx 4SX et du logiciel d'acquisition de données de guépard (Neuralynx). Les données brutes ont été acquises à 32 kHz avec un filtre passe-bande (1–6000 Hz). La stimulation de von Frey a été enregistrée par un transducteur piézo sur mesure (élément céramique piézo, pièce #717770, Conrad), qui a transduit la pression de la stimulation de von Frey en un signal analogique filtré à 1–2000 Hz31. De plus, des vidéos d'événements de stimulation mécanique ont été enregistrées par une caméra USB (20 images/seconde), synchronisées via un signal d'événement généré par le clavier avec le signal piézo. Le début de la stimulation a été défini comme le temps de contact du filament de von Frey avec la patte arrière correspondant à une déviation initiale du signal piézo en inspectant visuellement les enregistrements vidéo et piézo, respectivement.

Le potentiel de champ local (LFP) et l'activité unitaire ont été analysés avec des scripts personnalisés à l'aide de MATLAB63 (The Mathworks Inc, Version R2014a). L'analyse statistique et les tests post hoc ont été effectués dans Graphpad Prism (version 9).

Pour l'analyse par spectrogramme de l'activité LFP, 3 s avant et 3 s après le début de l'application du filament von Frey pour les essais de retrait ont été extraites des données brutes. Un canal d'une tétrode a été analysé par animal. Les épisodes de données brutes ont été filtrés avec un filtre passe-bas de type I de Chebyshev de 3ème ordre avec des ondulations de 0,5 dB dans la bande passante et une fréquence de bord de bande passante de 200 Hz et échantillonnée à 1000 Hz. Des spectrogrammes de puissance ont été générés avec la fonction d'ondelettes de Morlet, fixant la fréquence centrale à 0,8125 Hz, la précision de fréquence à 0,5 Hz et la résolution temporelle à 1 ms. La période de base de 1 s avant le début de la stimulation a été utilisée pour normaliser chaque segment de fréquence de 0,5 Hz par la moyenne respective, et exprimée en % d'écarts par rapport à la ligne de base de pré-stimulation. Les spectrogrammes de puissance normalisés des essais individuels ont ensuite été moyennés pour les filaments faibles et forts pour chaque souris et chaque jour. Les grandes moyennes moyennes de ces spectrogrammes normalisés pour tous les animaux sont présentées dans les Fig. 1e, 2c et Fig. 3a supplémentaire.

Pour l'analyse quantitative, les moyennes de quatre bandes de fréquences, y compris thêta (4–8 Hz), alpha (8–14 Hz), bêta (14–30 Hz) et gamma (30–100 Hz), dans les spectrogrammes de puissance de chaque animal ont été calculés sur l'ensemble de la période post-stimulation de 2 s. Pour l'analyse temporelle, les spectrogrammes normalisés de chaque animal ont été regroupés en bacs de 100 ms et les moyennes calculées pour chaque bande de fréquence. Le temps de retrait médian des essais correspondants pour un spectrogramme a été calculé comme référence. Pour corréler la force des filaments individuels avec l'augmentation de la puissance du spectrogramme, la puissance normalisée sur les 2 s post-stimulation a été moyennée pour chaque filament et bande de fréquence pour chaque animal.

Le tri des pointes a été effectué avec Kilosort264 pour isoler les unités individuelles. Les données brutes ont été prétraitées avec un filtre passe-bande de 300 à 6000 Hz. La correction de dérive, le regroupement d'unités et l'appariement de modèles ont été automatiquement effectués en fonction de la méthode d'appariement de modèles. Les unités regroupées automatiquement ont été sélectionnées manuellement dans Phy (version 2.0 ; https://github.com/cortex-lab/phy) à l'aide de la similarité des formes d'onde et des fonctionnalités de cluster, de la fréquence de déclenchement, ainsi que des fonctionnalités de corrélation croisée et d'auto-corrélation.

Pour l'analyse des changements d'activité évoquée dans les données unitaires, l'activité de tir de chaque essai de retrait a été alignée sur le début de la stimulation pour les essais de retrait de tous les filaments, ou séparément pour les groupes de filaments faibles et forts. Le taux de déclenchement dans les essais a été calculé pour des bacs de 250 ms et des scores z calculés sur la base de la moyenne et de l'écart type des activités de base de pré-stimulation de 3 s44. Les unités montrant une activité significativement augmentée ou diminuée ont été identifiées si au moins l'un des bacs normalisés dans la période post-stimulation de 3 s dépassait 3, 09 ou -3, 09, respectivement, correspondant à un niveau de signification de P <0, 001. Sinon, l'unité a été classée comme une unité qui ne répond pas. Les unités ont été exclues de cette analyse si la fréquence de déclenchement moyenne était inférieure à 1 Hz ou si le nombre d'essais de sevrage était inférieur à 3. Afin de comparer l'ampleur des réponses évoquées par stimulation, le score z maximal et minimal a été extrait pour toutes les unités. avec des taux de tir significativement augmentés ou diminués dans les périodes de post-stimulation de 3 s, respectivement.

Pour la classification unitaire, divers paramètres ont été calculés, notamment : la cadence de déclenchement, le coefficient de variation des intervalles inter-pointes, l'amplitude crête à crête de la forme d'onde, le temps entre les pics de forme d'onde précoces et tardifs, le temps entre le creux de la forme d'onde et le retour à la ligne de base et l'asymétrie de la forme d'onde (le quotient de la différence entre la ligne de base et le pic précoce et le pic tardif et le retour des temps de la ligne de base, à la somme de ces deux temps). Ces paramètres multidimensionnels ont été projetés en deux dimensions à l'aide de la fonction Matlab t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding)65. Ensuite, l'algorithme des k-moyennes a été appliqué pour regrouper ces unités en deux groupes. Sur la base de la séparation des clusters, la meilleure classification d'unité a été obtenue en utilisant seulement deux paramètres de forme d'onde : le paramètre d'asymétrie et le temps entre le creux et le retour à la ligne de base. Nous n'avons pas tenté de distinguer si les unités que nous avons classées étaient des neurones excitateurs ou inhibiteurs, et nous ne pouvons pas non plus distinguer les neurones de projection des interneurones.

Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM. sauf indication contraire. Prism (version 9) a été utilisé pour l'analyse statistique de toutes les données comportementales et pour effectuer des tests de comparaison post hoc d'ensembles de données électrophysiologiques. Un test t à un échantillon a été effectué pour détecter si des bandes de fréquences spécifiques du spectrogramme de puissance LFP des essais de sevrage s'écartaient significativement de la ligne de base de pré-stimulation. La méthode ROUT avec Q = 0,5 % a été utilisée pour tester les valeurs aberrantes. Une ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées avec le test de comparaison multiple de Dunnett pour les différences par rapport à la ligne de base de pré-stimulation a été utilisée pour l'analyse de l'évolution dans le temps de la Fig. 1g et de la Fig. 1b supplémentaire. Tous les ensembles de données groupés ont été analysés avec une ANOVA à deux voies en utilisant le test de Sidak pour des comparaisons multiples pour les combinaisons de traitement pertinentes qui avaient des effets significatifs sur le groupe principal. Le test t de Student non apparié a été utilisé pour tester les effets du traitement par rapport à un groupe témoin. Le test de contingence du chi carré pour les types de réponse unitaire (Fig. 2b supplémentaire) a été appliqué pour toutes les périodes de temps, ainsi que pour les combinaisons de périodes de temps par paires afin de détecter l'ensemble de données déviant. Dans tous les tests, une valeur P <0,05 était considérée comme significative.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données d'électrophysiologie générées dans cette étude ont été déposées dans le référentiel heiDATA sous le code d'accession [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X]. Les données sources sont fournies avec ce document.

Les scripts Matlab pour l'analyse des données électrophysiologiques sont disponibles avec les données brutes dans le même référentiel [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X].

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Les auteurs sont reconnaissants à C. Gartner pour son assistance en matière de secrétariat et à N. Gehrig, V. Buchert, D. Baumgartl-Ahlert et B. Zimmermann pour son excellente assistance technique. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft à RK sous forme de subventions dans le consortium CRC1158 douleur chronique (projet B01, B06). MO a reçu une subvention de démarrage des fonds CRC1158. Les auteurs tiennent à remercier ZG du Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, pour HL du China Scholarship Council et PVN du Studienstiftung des Deutschen Volkes (German National Merit Program) ainsi qu'une carrière de jeune scientifique. bourse des fonds CRC1158. Les auteurs remercient chaleureusement le centre interdisciplinaire neurocomportemental de la faculté de médecine de Heidelberg pour son aide dans les expériences comportementales et le service de stockage de données (SDS@hd) soutenu par le ministère des Sciences, de la Recherche et des Arts du Bade-Wurtemberg (MWK) et la Fondation allemande pour la recherche. (DFG) par subvention INST 35/1314-1 FUGG et INST 35/1503-1 FUGG.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Institut de pharmacologie, Faculté de médecine Heidelberg, Université de Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 366, 69120, Heidelberg, Allemagne

Manfred J. Oswald, Yechao Han, Han Li, Samuel Marashli, Deniz Nouri Oglo, Bhavya Ojha, Paul V. Naser, Zheng Gan et Rohini Kuner

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MO, YH, ZG, HL, DU, BO, SM et PVN ont effectué toutes les expériences humides sous la supervision de RKMO et ont aidé à la planification et à l'exécution des protocoles d'électrophysiologie. RK a conceptualisé le projet et tous les auteurs ont fourni des contributions conceptuelles régulières. MO, HL et ZG ont préparé les figures. RK a rédigé le manuscrit et tous les auteurs ont fourni des commentaires et des informations méthodiques lors de la rédaction du manuscrit et de la présentation des données.

Correspondance avec Rohini Kuner.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Patrick Sheets et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Oswald, MJ, Han, Y., Li, H. et al. Le noyau cholinergique du cerveau antérieur basal de Meynert régule le comportement de type douleur chronique via la modulation du cortex prélimbique. Nat Commun 13, 5014 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

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Reçu : 29 janvier 2022

Accepté : 03 août 2022

Publié: 25 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

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