Séquençage unicellulaire du transcriptome des neurones inspiratoires du complexe preBötzinger chez la souris néonatale

Données scientifiques volume 9, Numéro d'article : 457 (2022) Citer cet article

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Détails des métriques

Les neurones du complexe préBötzinger du tronc cérébral (preBötC) génèrent le rythme et le modèle moteur rudimentaire pour les mouvements respiratoires inspiratoires. Nous avons effectué des enregistrements patch-clamp de cellules entières à partir de neurones inspiratoires dans le préBötC de tranches de souris néonatales qui conservent la rythmicité liée à la respiration in vitro. Nous avons classé les neurones en fonction de leurs propriétés électrophysiologiques et de leur patrimoine génétique, puis avons aspiré leur contenu cellulaire pour le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq). Cet ensemble de données fournit les séquences nucléotidiques brutes (fichiers FASTQ) et les fichiers annotés des séquences nucléotidiques cartographiées sur le génome de la souris (mm10 d'Ensembl), qui comprend le nombre de fragments, la longueur des gènes et les fragments par kilobase de transcrit par million de lectures cartographiées (FPKM ). Ces données reflètent les transcriptomes des neurones qui génèrent le rythme et le schéma des mouvements respiratoires inspiratoires.

Des mesures)

séquences nucléotidiques

Type(s) de technologie

Séquençage Illumina

Type(s) de facteur(s)

génotype : neurones dérivés de Dbx1 vs. neurones non dérivés de Dbx1 dans le complexe pré-Bötzinger de souris • propriétés électrophysiologiques : neurones inspiratoires du complexe pré-Bötzinger de type 1 vs. type 2

Caractéristique de l'échantillon - Organisme

Muscle de souris

Caractéristique de l'échantillon - Environnement

environnement de laboratoire

Caractéristique de l'échantillon - Emplacement

États-Unis d'Amérique contigus

La phase active inexorable de la respiration est l'inspiration, dans laquelle la descente du diaphragme et l'élévation des côtes dilatent les poumons pour aspirer l'air1. Le rythme de l'inspiration émane du site inférieur du tronc cérébral appelé complexe préBötzinger (preBötC)2,3,4. Les éléments rythmogéniques de base du preBötC sont les interneurones dérivés de cellules précurseurs exprimant le gène homeobox Developing brain homeobox-1 (Dbx1), ci-après dénommés neurones Dbx15,6,7,8,9,10. Les neurones Dbx1 transmettent également le rythme inspiratoire en tant que modèle de sortie aux prémotoneurones et aux motoneurones des muscles de la pompe et des voies respiratoires11,12. L'inspiration commence par une phase préinspiratoire attribuée uniquement aux neurones rythmogènes11,13,14. Lorsque leur activité atteint un seuil, une bouffée inspiratoire se produit, qui recrute des neurones qui influencent et transmettent le modèle de sortie motrice13,14,15. Les neurones générateurs de rythmes et de motifs sont les deux sous-ensembles de la population de neurones Dbx1 dans le préBötC.

Les générateurs de rythme et de modèle peuvent être différenciés électrophysiologiquement. Les neurones de type 1 sont putativement rythmogènes. Ils s'activent avec une sommation en forme de rampe de potentiels synaptiques 300 à 500 ms avant le début d'une salve inspiratoire de grande amplitude16,17. Les neurones de type 1 expriment un courant K+ transitoire de type A (IA). Le blocage de l'IA déstabilise le rythme inspiratoire et l'activité préinspiratoire globale in vitro18. Les neurones de type 2 sont putativement spécialisés pour générer le modèle de sortie. Ils s'activent ~ 300 ms plus tard que le Type-116,17 et expriment un courant cationique mixte activé par hyperpolarisation (Ih), dont la manipulation affecte la sortie du moteur19.

Nous avons différencié électrophysiologiquement les neurones de type 1 et de type 2 lors d'enregistrements patch-clamp de cellules entières. Malgré la disparité bien caractérisée entre les types, certains neurones présentent une physiologie ambiguë et ne peuvent pas être classés de manière fiable ; nous les appelons Inconnus mais les considérons néanmoins importants pour la respiration car ils sont dans le préBötC et sont rythmiquement actifs en phase avec l'inspiration in vitro. Nous avons récupéré le contenu cytoplasmique et effectué un séquençage d'ARN de nouvelle génération sur 10 échantillons : quatre neurones de type 1 (trois provenant de précurseurs exprimant Dbx1 et un obtenu à partir d'une souris de type sauvage CD-1 sans rapporteur Dbx1), un neurone de type 2 d'un précurseur exprimant Dbx1, ainsi que 5 neurones inconnus de souris de type sauvage CD-1. Tous les neurones ont été enregistrés et l'ARN extrait dans les deux mois et envoyé ensemble pour le séquençage de nouvelle génération.

Le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de William & Mary a approuvé ces protocoles, qui sont conformes aux politiques de l'Office of Laboratory Animal Welfare (National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis) et aux directives du National Research Council20. Des souris CD-1 (Charles River, Wilmington, MA) et des souris génétiquement modifiées (décrites ci-dessous) ont été maintenues sur un cycle de lumière de 14 heures/obscurité de 10 heures à 23 ° C et ont été nourries à volonté avec un accès libre à l'eau.

Les expériences ont utilisé des souris CD-1 ou un modèle de souris intersectionnel appelé Dbx1;Ai148. Concernant la nomenclature du modèle intersectionnel, la première partie fait référence aux souris Dbx1Cre (IMSR Cat# EM:01924, RRID:IMSR_EM:01924) qui expriment la recombinase Cre pilotée par le promoteur Dbx121. La deuxième partie, Ai148 (IMSR Cat# JAX:030328, RRID:IMSR_JAX:030328), fait référence aux souris Cre-responder créées par l'Allen Brain Institute qui expriment l'indicateur fluorescent Ca2+ GCaMP6f suite à la recombinaison médiée par Cre d'allèles floxés22. Nous avons croisé des souris femelles Dbx1Cre avec des mâles Ai148 pour produire une progéniture avec l'expression de GCaMP6f dans les neurones dérivés de Dbx1.

Nous avons nettoyé tous les espaces de travail avec RNase ZAP (Thermo Fisher, Waltham, MA) avant chaque expérience. Les outils et la verrerie ont été autoclavés ou nettoyés avec de la RNase ZAP puis rincés avec de l'eau sans nucléase (NFW).

Nous avons anesthésié des chiots CD-1 ou Dbx1;Ai148 (âgés de 0 à 3 jours après la naissance, c'est-à-dire P0-3) par hypothermie conformément aux directives de l'American Veterinary Medical Association (AVMA, Schaumburg, IL) version 2020.0.1, qui est sous licence sous Creative Commons Attribution-Non-Commercial-NoDerivs 3.0. Nous avons retiré le neuraxis du pont vers la moelle épinière cervicale en 2 min et l'avons placé dans du liquide céphalo-rachidien artificiel glacé (aCSF) contenant (en mM) : 124 NaCl, 3 KCl, 1,5 CaCl2, 1 MgSO4, 25 NaHCO3, 0,5 NaH2PO4 et 30 dextrose. L'aCSF a été préparé à l'avance dans un environnement sans RNase, puis bouillonné avec 95 % d'O2 et 5 % de CO2 tout au long des expériences. Le neuraxis a été coupé pour isoler le tronc cérébral, puis collé à la surface dorsale d'un bloc de gélose, puis positionné dans un étau à l'intérieur d'un vibratome (Campden Instruments 7000 smz-2, Leicester, Royaume-Uni) rempli d'aCSF glacé aéré par 95 % O2 et 5 % CO2. Nous avons coupé une tranche transversale de 450 à 500 µm d'épaisseur avec preBötC sur sa face rostrale23. La tranche a été utilisée pendant pas plus de 3 heures pour éviter la dégradation et la contamination du contenu génétique cytoplasmique.

La figure 1a (en haut) montre notre flux de travail d'électrophysiologie. Nous avons perfusé des tranches avec aCSF (28 ° C) à 2–4 ml / min dans une chambre d'enregistrement sur un microscope de physiologie (Zeiss Axio Examiner, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne). La concentration externe en K + du aCSF a été augmentée de 3 à 9 mM pour faciliter un rythme respiratoire robuste et une sortie motrice hypoglosse (XII)4,24. Nous avons enregistré la sortie du moteur XII à l'aide d'électrodes d'aspiration fabriquées à partir de pipettes en verre borosilicaté autoclavées (OD : 1,2 mm, ID : 0,68 mm), initialement tirées sur un extracteur de micropipette Flaming-Brown P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA), puis polies au feu jusqu'à un diamètre d'environ 100 µm. La sortie du moteur XII a été amplifiée de 2 000 à l'aide d'un amplificateur différentiel (EX1, Dagan Instruments, Minneapolis, MN), filtrée par passe-bande à 0,3–1 kHz et lissée pour l'affichage à l'aide d'un filtre analogique à moyenne quadratique (Analog Devices, Norwood , MA) pour fournir une forme d'onde XII rectifiée et lissée pleine onde. Dans les tranches de souris Dbx1;Ai148, nous avons identifié les neurones inspiratoires Dbx1 preBötC sur la base des changements de fluorescence rythmique en synchronisation avec la sortie XII avant d'obtenir un enregistrement patch-clamp de cellule entière. Chez les souris CD-1, nous avons identifié des neurones inspiratoires préBötC qui s'activaient en synchronisation avec la sortie du moteur XII après avoir établi l'enregistrement de cellules entières. Nous avons fabriqué des pipettes patch en verre borosilicaté autoclavé (OD : 1,5 mm, ID : 0,86 mm) en utilisant un programme en 4 étapes sur l'extracteur de micropipette Flaming-Brown P-97. Résistance de pointe mesurée de 3 à 5 MΩ. Nous avons rempli des pipettes patch avec une solution interne, mélangée dans un environnement sans RNase, contenant (en mM) : 123 K-gluconate, 12 KCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP, 10 Na2-phosphocréatine , et 13 Glycogène. Nous avons ajusté l'osmolarité de la solution interne (patch) à 260–270 mOsm et maintenu le pH à 7,25. Nous avons ajouté 1 à 2,5 % d'inhibiteur de ribonucléase recombinant (RRI) (Takara Bio USA, Mountain View, CA) à la solution interne immédiatement avant chaque expérience pour préserver l'ARN. Des micromanipulateurs robotiques (Sensapex, Helsinki, Finlande) ont été utilisés pour positionner les pipettes patch adjacentes aux neurones inspiratoires sous contrôle visuel. Nous avons effectué des enregistrements patch-clamp de cellules entières à l'aide d'un amplificateur patch-clamp EPC-10 (HEKA Instruments, Holliston, MA) avec le logiciel PATCHMASTER (RRID:SCR_000034).

Aperçu schématique de la conception expérimentale. (a) Le flux de travail Patch-Seq. Les neurones préBötC dérivés de Dbx1 rythmiquement actifs sont enregistrés dans la configuration patch-clamp de cellule entière (VM, trace supérieure). Le nerf crânien hypoglosse (XII) représente la sortie motrice liée à l'inspiration (tracé du bas). a_i – a_iv représentent graphiquement les étapes du flux de travail Patch-Seq comme détaillé dans Méthodes. ( b ) Organigramme b_i – b_v montrant le flux de travail bioinformatique tel que détaillé dans les méthodes.

Nous avons défini la latence d'entraînement inspiratoire comme le temps écoulé entre le début de la sommation des potentiels synaptiques excitateurs (EPSP), qui dépolarisent le neurone de son potentiel membranaire au repos entre les rafales inspiratoires, jusqu'au début de la rafale inspiratoire. La latence de la commande inspiratoire a été utilisée, en partie, pour déterminer si un neurone était de type 1 ou de type 2 (Fig. 1ai). Les neurones préBötC de type 1 présentent une latence de commande inspiratoire supérieure à 300 ms, tandis que les neurones préBötC de type 2 présentent une latence de commande inspiratoire de l'ordre de 100 ms (comparer Fig. 2a, gauche et b, gauche).

Profils électrophysiologiques des neurones préBötC. (a) un neurone de type 1 caractérisé par une longue latence d'entraînement inspiratoire (à gauche), une excitation retardée (au milieu) et l'absence d'un potentiel d'affaissement (à droite). (b) un neurone de type 2 caractérisé par une courte latence d'entraînement inspiratoire (à gauche), aucune excitation retardée (au milieu) et la présence d'un potentiel d'affaissement (à droite).

Nous avons testé le courant K + de type A (IA), caractéristique des neurones préBötC de type 1, en appliquant des commandes de courant dépolarisant supraliminaire d'une durée de 500 ms à partir d'un potentiel de maintien de -70 mV. Les neurones préBötC de type 1 exprimant IA présentaient une excitation retardée de 120 à 220 ms, tandis que les neurones préBötC de type 2 sans expression IA ne présentaient pas d'excitation retardée en réponse à des commandes de pas de courant dépolarisantes similaires16,17,25 (comparer Fig. 2a, middle vs. b, milieu).

Nous avons testé le courant cationique activé par hyperpolarisation (Ih) en appliquant des commandes de pas de courant hyperpolarisant d'une durée de 400 à 500 ms, ce qui a provoqué des excursions de tension initiales dépassant -20 mV à partir d'un potentiel de maintien de -50 mV. Les neurones préBötC de type 2 exprimant Ih présentaient un «affaissement» dépolarisant dépendant du temps et de la tension, tandis que les neurones préBötC de type 1 sans expression Ih ne présentaient pas de potentiels d'affaissement en réponse à des commandes de pas de courant hyperpolarisant similaires16, 17, 25 (comparer Fig. 2a , droite contre b, droite).

La figure 1a (en bas) montre un schéma de notre flux de travail pour obtenir le contenu cytoplasmique et créer une bibliothèque d'ADN complémentaire (ADNc) adaptée au séquençage de nouvelle génération. Après avoir classé les neurones en Type-1 ou Type-2 sur la base de la latence de la commande inspiratoire et de l'expression, ou de son absence, de IA et Ih ; ou en les classant comme Inconnu, nous avons extrait le contenu cellulaire par une pression négative de 0,7 à 1,5 psi (Fig. 1aii). La pipette patch a été rétractée rapidement et le contenu de la pipette a été éjecté en cassant sa pointe au fond d'un tube PCR sans RNase contenant 4 µL d'eau sans nucléase avec 2 % de RRI. L'échantillon a été centrifugé brièvement, congelé immédiatement par immersion dans de l'azote liquide, puis stocké à –80 °C. Nous avons converti l'ARN extrait en ADNc selon le kit d'ARN à entrée ultra-faible SMART-Seq v4 (Takara Bio USA) pour le protocole de séquençage (Fig. 1aiii). L'ADNc du premier brin a été synthétisé en effectuant une transcription inverse dans un cycleur thermique (42 ° C pendant 90 min, 70 ° C pendant 10 min). L'ADNc a ensuite été amplifié à 95 °C pendant 1 min, 17 cycles de 98 °C pendant 10 s, 65 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 3 min ; 72 °C pendant 10 min. L'ADNc amplifié par PCR a été purifié par immobilisation sur des billes AMPure (Beckman Coulter, Brea, CA), que nous avons lavées avec de l'éthanol à 80 % avant d'éluer l'ADNc des billes. L'ADNc amplifié a été validé à l'aide du bioanalyseur Agilent 2100 et du kit haute sensibilité Agilent (5067-4626, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Les échantillons qui ont franchi un seuil de 20 unités de fluorescence dans la plage de 1 500 à 2 000 paires de bases, avec peu ou pas de pic dans la région de 100 à 500 paires de bases (par exemple, Fig. 1aiii) ont ensuite été quantifiés à l'aide du kit de dosage haute sensibilité Qubit dsDNA (Sondes moléculaires, Eugene, OR). Les échantillons avec une concentration d'ADNc supérieure à 150 pg/µL ont été conservés pour le séquençage de nouvelle génération26. Nous avons traité l'ADNc complet à l'aide des kits de préparation de bibliothèque Nextera (FC-131-1024, Illumina, San Diego, CA) pour obtenir des bibliothèques d'ADNc pour le séquençage de nouvelle génération à l'aide d'un Illumina HiSeq. Système de séquençage 4000 avec lectures appariées (150 pb) (Fig. 1aiv). Les enquêteurs ont été aveuglés au type de cellule lors de la construction de la bibliothèque et du séquençage.

La figure 1b montre le schéma de notre flux de travail bioinformatique. Tout d'abord, la qualité des lectures a été vérifiée à l'aide de FastQC v0.11.8 (Fig. 1bi). Les lectures d'adaptateur (lecture 1 : TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG, lecture 2 : GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG) ont été ajustées à l'aide de bbduk v38.00 à l'aide de la commande suivante (Fig. 1bii) :

sh bbduk.sh in1 = inputFASTQFile1.fastq. in2 = inputFASTQFile2.fastq out1 = outputFASTQFile1.fastq out2 = outputFASTQFile2.fastq ktrim = r -Xmx27g mm = fk = 33 hdist = 1 littéral = TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG, GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAG tbo tpe

Nous avons utilisé le génome de référence de la souris mm10 d'Ensembl (de l'Institut européen de bioinformatique de la famille du Laboratoire européen de biologie moléculaire) pour créer un répertoire du génome permettant d'aligner les lectures dans STAR27 v2.7.7a à l'aide des commandes suivantes :

STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir mm10ReferenceGenome --genomeFastaFiles Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Mus_musculus.GRCm38.102.gtf --sjdbOverhang 149 -- genomeSAsparseD 2

Les séquences ont ensuite été alignées sur le génome de référence mm10 par STAR v2.7.7a27 en utilisant la commande suivante (Fig. 1biii) :

STAR --genomeDir mm10ReferenceGenome --readFilesIn inputFASTQFile1.fastq inputFASTQFile2.fastq -- outFileNamePrefix outputBAMFile --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --outReadsUnmapped Fastx

Nous avons utilisé featureCounts v2.4.2 pour quantifier le nombre de fragments des gènes détectés (Fig. 1biv). De plus, nous avons développé des scripts personnalisés (voir Disponibilité du code, ci-dessous) dans l'environnement informatique statistique "R" pour générer des fichiers texte contenant des longueurs de gènes, des nombres de fragments et des FPKM, qui sont disponibles sur NCBI GEO (Fig. 1bv).

Les données brutes constituées de séquences de nucléotides (fichiers FASTQ) ainsi que le nombre de fragments bruts des données traitées après alignement sur mm10 (GSE175643_fragmentCounts.txt.gz), les valeurs FPKM des gènes représentés dans les fragments (GSE175643_fpkm.txt.gz) , et les longueurs des gènes à partir de mm10 (GSE175643_geneLength.txt.gz) sont accessibles au public dans la base de données NCBI GEO (GEO:GSE175643)28.

Le dossier déposé chez Figshare intitulé "Electrophysiological properties of inspiratory preBötzinger complex neurons in neonatal mouses (GEO:GSE175643)" présente le profil électrophysiologique de chaque échantillon de neurone préBötC du jeu de données29. Le fichier déposé chez Figshare intitulé "Mapping statistics for nucleotide sequences for inspiratory preBötzinger complex neurons in neonatal mouses (GEO:GSE175643)" fournit un ensemble de statistiques de STAR concernant le nombre de lectures, et leurs longueurs, cartographiées sur le génome de référence mm1029.

Nous avons vérifié la taille et l'abondance moyennes de l'ADNc à l'aide d'un kit Bioanalyzer High Sensitivity (Agilent, Santa Clara, CA) et d'un kit de dosage Qubit dsDNA High-sensitivity (Molecular Probes). Les données brutes des séquences nucléotidiques ainsi que leurs scores de qualité correspondants (format FASTQ) sont accessibles au public dans la base de données NCBI GEO (GEO:GSE175643).

En ce qui concerne les scores de qualité, les 20 rapports FastQC (deux lectures appariées de 10 échantillons de neurones préBötC) ont montré des scores de qualité par séquence en moyenne de 38 à 40. Aucune des séquences n'a été signalée comme étant de mauvaise qualité.

Les données de transcriptome décrites ici ont été recueillies à l'aide de techniques identiques aux données analysées dans Kallurkar et al. Sci Rep, 12:2923, 2022, qui se composait de 17 neurones préBötC Dbx1 (sept de type 1, neuf de type 2 et un inconnu)25. Ci-après, nous nous référons à ces données comme "Kallurkar 2022". Cependant, les données actuelles ont été collectées et envoyées pour séquençage environ 1,5 ans à l'avance, nous avons donc souhaité tester un effet de lot qui pourrait entraîner une variation entre ces deux ensembles de données. Pour dépister la disparité des effets de lot, nous avons créé des boîtes à moustaches30 pour chaque échantillon résumant l'expression logarithmique de 8 916 gènes avec une expression non nulle dans plus des deux tiers des échantillons de Kallurkar 2022 et de l'ensemble de données actuel (c'est-à-dire 19 sur 27 au total échantillons). Ces 8 916 gènes représentent 16 % des 55 367 gènes du génome de référence mm10. La figure 3 montre que le log10 médian (FPKM) oscille autour de 1,0 sur Kallurkar 2022 (boîtes à moustaches grises, échantillons 1 à 9 et 11 à 18) et les données actuelles (boîtes à moustaches noires, échantillons 1 à 10). La longueur des boîtes à moustaches, qui couvrent les quartiles inférieur et supérieur, est généralement d'une décennie (c'est-à-dire un facteur de 10 en FPKM), mais certaines peuvent atteindre trois décennies (un facteur de 1000 en FPKM). Cependant, les échantillons 1 à 4 du présent ensemble de données montrent un log10 médian (FPKM) <0,5 et une longueur de boîte de trois décennies. Ces statistiques indiquent que les échantillons 1 à 4 présentent des niveaux d'expression plus faibles, pour une partie des gènes détectés, et une variabilité plus élevée par rapport à Kallurkar 2022 et aux échantillons 5 à 10. Pour explorer davantage les niveaux d'expression et la variabilité, nous avons tracé la médiane log10 (FPKM) par rapport à l'écart absolu médian (MAD) de log10 (FPKM) (Fig. 4). Les échantillons 1 à 4 (cercles pleins avec des chiffres) sont positionnés en haut à gauche par rapport aux échantillons 5 à 10 (cercles pleins) et Kallurkar 2022 (cercles ouverts), ce qui est à nouveau cohérent avec une expression génique plus faible et une variabilité plus élevée. Enfin, nous avons examiné un histogramme de log10 (FPKM) pour Kallurkar 2022 et les données actuelles (Fig. 5). Kallurkar 2022 (ligne grise) se superpose bien aux échantillons 5 à 10 (ligne noire continue) et au pic le plus élevé des échantillons 1 à 4 dans l'ensemble de données actuel (ligne noire discontinue). Cependant, les échantillons 1 à 4 présentent un autre pic dans la distribution à log10 (FPKM) près de -2, indiquant un ensemble de gènes faiblement exprimés responsables de la variabilité plus élevée des échantillons 1 à 4. Notamment, les échantillons 1 à 4 présentaient la plus faible concentration d'ADNc selon la quantification Qubit, bien que tous les quatre aient satisfait au critère de 150 pg/µL26. Les échantillons 1 à 4 ont un log10 médian (FPKM) inférieur d'un facteur 10 aux échantillons 5 à 10 et à Kallurkar 2022 (Fig. 5, lignes verticales).

Boîtes à moustaches montrant les niveaux d'expression des 8 916 gènes exprimés dans 19 transcriptomes de neurones préBötC de Kallurkar et al., 2022 (réf. 25) ou des 10 échantillons du présent rapport. Les ensembles de données de Kallurkar 2022 sont les échantillons 1 à 9 et 11 à 18 (diagrammes en boîte grise). Les ensembles de données actuels sont les échantillons 1 à 10 (boîtes noires). Le log10 médian (FPKM) est indiqué par un point de boudine au centre de la boîte à moustaches, qui montre les quartiles supérieur et inférieur. Les points indiquent les niveaux d'expression des gènes en dehors de la plage interquartile.

Un graphique de l'écart absolu médian (MAD) de log10(FPKM) par rapport à log10 médian(FPKM) des 8 916 gènes exprimés dans au moins 19 transcriptomes de neurones préBötC de Kallurkar et al., 2022 (réf. 25) ( cercles vides) ou les 10 échantillons du présent rapport (cercles pleins). Les échantillons 1 à 4 avec un MAD élevé et une expression médiane faible sont en outre indiqués par des chiffres correspondant au nom de l'échantillon.

Histogramme montrant la probabilité du niveau d'expression génique pour les 8 916 gènes exprimés dans au moins 19 transcriptomes de neurones préBötC de Kallurkar et al., 2022 (réf. 25) (ligne continue grise) ou des 10 échantillons du présent rapport (ligne noire brisée pour les échantillons 1 à 4 et ligne noire continue pour les échantillons 5 à 10). Les hauteurs du premier bac (0,13, 0,05 et 0,09) correspondent à la fraction de gènes mm10 non exprimés dans les ensembles de données Kallurkar 2022 et actuels.

Nous avons en outre comparé les données actuelles à Kallurkar 2022 en cartographiant les statistiques. La fraction de zéros (c'est-à-dire la fraction de gènes en mm10 qui n'a pas été détectée) était de 0,775 dans les données actuelles et de 0,762 dans Kallurkar 2022. Le fichier déposé à Figshare intitulé "Mapping statistics for nucleotide sequences for inspiratory preBötzinger complex neurons in neonatal mouses ( GEO:GSE175643)" répertorie les statistiques de cartographie en détail pour les séquences nucléotidiques cartographiées de manière unique, multi-cartographiées ou non cartographiées sur le génome de référence de la souris mm1030. Les statistiques de cartographie pour Kallurkar 2022 sont associées à la réf. 25. En bref, 0,85 ± 0,04 représente la fraction de séquences du présent ensemble de données mappées uniquement à mm10, 0,05 ± 0,02 représente la fraction multi-cartographiée et 0,10 ± 0,03 représente la fraction non cartographiée. Dans Kallurkar 2022, 0,56 ± 0,14 représente la fraction de séquences cartographiées de manière unique à mm10, 0,04 ± 0,01 représente la fraction multi-cartographiée et 0,16 ± 0,07 représente la fraction non cartographiée.

Nous notons en outre que les rapports de qualité pour Kallurkar 2022 et les données actuelles renvoient des scores similaires pour la "qualité de séquençage par base", qui était de 35 ou plus et aucune séquence signalée comme étant de mauvaise qualité.

Dans l'ensemble, les boîtes à moustaches d'expression logarithmique et les analyses de suivi excluent une variation technique majeure entre le Kallurkar 2022 et les ensembles de données actuels, avec la mise en garde qu'une partie des gènes détectés dans les échantillons 1 à 4 ont montré une expression globale plus faible et une variabilité plus élevée par rapport à échantillons 5 à 10 et tous les échantillons de Kallurkar 2022. Néanmoins, la fraction relativement élevée de séquences cartographiées de manière unique et la faible fraction de séquences non cartographiées soulignent la qualité de l'ensemble de données actuel.

Revenant à notre examen du présent ensemble de données, six neurones inspiratoires préBötC ont été enregistrés chez des souris CD-1. Nous n'avons pu différencier qu'un seul neurone de type 1 dans des tranches de souris CD-1 ; les cinq autres étaient de type Inconnu. Nous sommes relativement convaincus que le neurone de type 1 était excitateur et rythmogène sur la base de ses propriétés membranaires. Cependant, nous ne pouvons pas être sûrs du type de transmetteur ou de la fonction respiratoire des cinq neurones inconnus des souris de type sauvage CD-1.

Sur les quatre neurones Dbx1 preBötC, nous avons détecté trois Type-1 mais un seul Type-2. Il serait difficile de tirer des conclusions sur l'expression différentielle entre les neurones préBötC Dbx1 de type 1 et de type 2 sur la base d'un seul transcriptome de type 2. Compte tenu des effets de lot minimes (voir ci-dessus), on pourrait ici analyser le transcriptome de type 2 avec les transcriptomes précédemment diffusés dans le rapport de Kallurkar et al.25.

Dans les Fig. 6 et 7, nous mettons en évidence les niveaux d'expression des gènes qui sont d'intérêt commun pour les physiologistes respiratoires. Les barres sont codées par couleur pour indiquer Type-1 (magenta), Type-2 (orange) et Inconnu (vert). La hauteur des barres correspond au niveau d'expression log2(FPKM) pour chaque gène. Les barres violettes indiquent la moyenne et l'écart-type sur l'ensemble de l'échantillon. La figure 6 comprend les récepteurs synaptiques ionotropes et métabotropes, les neuropeptides, les récepteurs de neuropeptide, les canaux potentiels de récepteurs transitoires (c'est-à-dire Trp) et la reeline (rln). La figure 7 présente les canaux ioniques voltage-dépendants, les sous-unités régulatrices et les récepteurs intracellulaires.

Niveaux d'expression génique pour les récepteurs synaptiques ionotropes et métabotropes, les neuropeptides, les récepteurs de neuropeptide, les canaux potentiels de récepteur transitoire (c.-à-d. Trp) et la reeline (rln). La première barre (violette) représente le niveau d'expression génique global pour tous les échantillons (N = 10). Les barres à droite sont regroupées par type de neurone, dans l'ordre de leur inscription sur la base de données NCBI GEO (#GSE175643) : les échantillons 1 à 6 proviennent de souris CD-1 ; les échantillons 7 à 10 proviennent de souris Dbx1;Ai148. Les neurones de type 1 (roses) correspondent aux échantillons 4 à 7 ; le neurone de type 2 (orange) correspond à l'échantillon 1 ; et Les neurones inconnus (verts) correspondent aux échantillons 2, 3, 8–10. La hauteur de la barre représente la valeur log2 (moyenne FPKM) ; les barres d'erreur indiquent l'écart type sur tous les échantillons (barres violettes uniquement).

Expression génique pour les canaux ioniques voltage-dépendants, les sous-unités régulatrices et les récepteurs intracellulaires. La première barre (violette) représente le niveau d'expression génique global pour tous les échantillons (N = 10). Les barres à droite sont regroupées par type de neurone, dans l'ordre de leur inscription sur la base de données NCBI GEO (#GSE175643) : les échantillons 1 à 6 proviennent de souris CD-1 ; les échantillons 7 à 10 proviennent de souris Dbx1;Ai148. Les neurones de type 1 (roses) correspondent aux échantillons 4 à 7 ; le neurone de type 2 (orange) correspond à l'échantillon 1 ; et Les neurones inconnus (verts) correspondent aux échantillons 2, 3, 8–10. La hauteur de la barre représente la valeur log2 (moyenne FPKM) ; les barres d'erreur indiquent l'écart type sur tous les échantillons (barres violettes uniquement).

Les neurones dont nous présentons ici les transcriptomes sont la même population de neurones dérivés de Dbx1 et non dérivés de Dbx1 décrite par Hayes et ses collègues31. Cependant, dans cette étude, les neurones préBötC n'ont pas été enregistrés de manière intracellulaire. On pourrait comparer les transcriptomes actuels des neurones préBötC à ceux de Hayes et al. sachant que les phénotypes physiologiques de ces derniers neurones n'ont pas été identifiés31.

Les scripts R personnalisés écrits pour traiter le nombre de fragments bruts sont disponibles gratuitement (https://github.com/prajkta9/bioinformatics-scRNA-seq).

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Financé par NIH R01 HL104127 (PI : Del Negro), NIH R01 NS107296 (PI : Del Negro), NIH R01 AT01816 (PI : Conradi Smith et Del Negro), NSF DMS 1951646 (PI : Conradi Smith), NSF DEB 2031275 (PI : Conradi Smith), NIH R15 HD096415 (IP : Saha). Les auteurs remercient Kyle T. David (ID ORCID : 0000-0001-9907-789X) qui a aidé avec le script R personnalisé pour produire la Fig. 2.

Département des sciences appliquées, William & Mary, 540 Landrum Drive, Williamsburg, Virginie, 23185, États-Unis

Caroline K. David, Prajkta S. Kallurkar, Maria Cristina D. Picardo, Gregory D. Conradi Smith et Christopher A. Del Negro

Département de neurosciences, École de médecine de l'Université Jikei, 3-25-8 Nishi-shimbashi, Minato, Tokyo, 105-8461, Japon

Yae K. Sugimura

Département de biologie, William & Mary, 540 Landrum Drive, Williamsburg, Virginie, 23185, États-Unis

Margaret S.Saha

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Caroline K. David a organisé les données, conçu et créé certaines des figures et écrit des parties du manuscrit avec CADN. Yae K. Sugimura a aidé à concevoir l'étude, a enregistré les neurones préBötC en mode patch-clamp de cellules entières, a caractérisé les neurones, puis a collecté leur contenu cytoplasmique pour l'amplification et le séquençage, et a aidé à éditer le manuscrit. Prajkta S. Kallurkar a aidé à concevoir l'étude, a aidé à enregistrer les neurones préBötC en mode patch-clamp de cellules entières, à collecter leur contenu cytoplasmique pour l'amplification et le séquençage, a effectué des travaux bioinformatiques tels que l'alignement des séquences sur mm10 et a également aidé à analyser les données. comme écrire et éditer le manuscrit. Maria Cristina D. Picardo a aidé à concevoir l'étude, a préparé la bibliothèque d'ADNc à partir des échantillons, a envoyé la bibliothèque d'ADNc pour le séquençage, a organisé les données et a aidé à la bioinformatique, et a aidé à écrire et à éditer le manuscrit. Margaret S. Saha a aidé à concevoir l'étude, à concevoir et à affiner les protocoles expérimentaux, à évaluer la qualité des données, à analyser les effets de lot et à rédiger et éditer le manuscrit. Gregory D. Conradi Smith a aidé à concevoir et à affiner les protocoles bioinformatiques, évalué la qualité des données alignées sur le génome, aidé à analyser les effets de lot, réalisé certaines figures et écrit et édité des parties du manuscrit. Christopher A. Del Negro a aidé à concevoir l'étude, a dirigé les efforts expérimentaux et bioinformatiques, a réalisé certaines des figures et a écrit le manuscrit avec CKD.

Correspondance à Christopher A. Del Negro.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

David, CK, Sugimura, YK, Kallurkar, PS et al. Séquençage unicellulaire du transcriptome des neurones inspiratoires du complexe preBötzinger chez la souris néonatale. Sci Data 9, 457 (2022). https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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Reçu : 10 mars 2022

Accepté : 19 juillet 2022

Publié: 30 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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Séquençage unicellulaire du transcriptome des neurones inspiratoires du complexe preBötzinger chez la souris néonatale