Structure de la cellule NK humaine NKR

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 5022 (2022) Citer cet article

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La signalisation par le récepteur de type lectine humain de type C, le récepteur inhibiteur des cellules tueuses naturelles (NK) NKR-P1, joue un rôle essentiel dans de nombreuses maladies et cancers liés au système immunitaire. Les récepteurs de type lectine de type C ont de faibles affinités avec leurs ligands ; par conséquent, la mise en place d'un modèle complet d'interactions NKR-P1-LLT1 qui considère l'état naturel du récepteur à la surface de la cellule est nécessaire pour comprendre ses fonctions. Nous rapportons ici les structures cristallines des complexes NKR-P1 et NKR-P1: LLT1, ce qui prouve que NKR-P1 forme des homodimères dans un arrangement inattendu pour permettre la liaison de LLT1 en deux modes, reliant deux molécules LLT1. Ces clusters d'interaction suggèrent une synapse immunitaire inhibitrice. En observant la formation de ces clusters en solution par analyse SEC-SAXS, par microscopie super-résolution dSTORM sur la surface cellulaire, et en suivant leur rôle dans la signalisation des récepteurs avec des cellules NK fraîchement isolées, nous montrons que seule la ligature des deux liaisons LLT1 interfaces conduit à une signalisation inhibitrice efficace de NKR-P1. En résumé, nos résultats soutiennent collectivement un modèle de regroupement NKR-P1: LLT1, qui permet aux protéines en interaction de surmonter la faible affinité ligand-récepteur et de déclencher la transduction du signal lors du contact cellulaire dans la synapse immunitaire.

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont des lymphocytes immunitaires innés équipés d'une large gamme de récepteurs de surface activateurs et inhibiteurs, leur permettant de reconnaître et de tuer avec sensibilité les cellules malignes, infectées ou transformées par le biais de mécanismes "manquants" et "auto-induits" et grâce à la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC)1. De plus, les cellules NK contribuent également à l'initiation et au développement de la réponse immunitaire adaptative, sécrétant plusieurs classes de cytokines, notamment l'IFN-γ1 pro-inflammatoire. Fait intéressant, des découvertes récentes montrent que les cellules NK peuvent même maintenir une forme de mémoire immunologique1,2, soulignant ainsi davantage les rôles principaux que jouent les cellules NK dans l'immunité, en particulier via leurs récepteurs.

Les récepteurs NK comprennent deux classes structurellement divergentes : les familles des récepteurs de type immunoglobuline et les récepteurs de type lectine de type C (CTLR)3,4. Les CTLR sont codés dans le complexe de gènes tueurs naturels (NKC, chromosome humain 12) et, contrairement aux lectines de type C, les CTLR ne se lient pas aux ions calcium ni n'engagent les ligands glucidiques5,6. Au lieu de cela, les CTLR sont connus pour interagir avec les ligands protéiques. Par exemple, des récepteurs tels que Ly49, CD94/NKG2 ou NKG2D reconnaissent les molécules de type MHC de classe I3, tandis que les récepteurs de la sous-famille NKR-P1 reconnaissent des CTLR Clr/Ocil structurellement très apparentés. Ceux-ci sont codés par les gènes CLEC23,5 génétiquement étroitement liés aux gènes KLR codant NKR-P1. Ce système d'interaction unique CTLR:CTLR est impliqué à la fois dans la reconnaissance du soi manquant non-MHC et du soi induit3,4,5. Plusieurs récepteurs NKR-P1 inhibiteurs et activateurs ont été décrits chez la souris et le rat ; cependant, le récepteur humain NKR-P1 (CD161, gène KLRB1) reste depuis 1994 le seul orthologue humain décrit à ce jour7. Néanmoins, sur la base de l'homologie structurelle et fonctionnelle avec NKR-P1, les paires CTLR:ligand activatrices humaines NKp65:KACL (KLRF2:CLEC2A)8 et NKp80:AICL (KLRF1:CLEC2B)9 ont été proposées comme homologues activatrices de NKR-humain. P14,10.

Le NKR-P1 humain (CD161) a été signalé pour la première fois comme un marqueur des cellules NK7, dans lequel le NKR-P1 agit comme un récepteur inhibiteur7,11,12 régulé positivement par l'IL-1213. Cependant, NKR-P1 est également exprimé par les cellules T tueuses naturelles (NKT)14, les cellules T invariantes associées aux muqueuses (MAIT)15 et d'autres sous-ensembles de lymphocytes T16, où NKR-P1 agit comme un récepteur co-stimulateur, augmentant l'IFN- sécrétion γ11,17. Sans surprise, NKR-P1 est même détecté dans les cellules immatures CD16−CD56−NK18 et dans les précurseurs des cellules Th17 et MAIT dans le sang du cordon ombilical19. Récemment, NKR-P1 a été identifié dans les lymphocytes T infiltrant le gliome, ayant un rôle inhibiteur et immunosuppresseur dans la destruction médiée par les lymphocytes T des cellules de gliome20. De plus, NKR-P1 favorise la migration transendothéliale vers des niches immunologiquement privilégiées lors de l'interaction avec son ligand endogène, le transcrit de type lectine 1 (LLT1)19,21,22.

LLT1 (gène CLEC2D) est principalement exprimé sur les monocytes activés et les cellules B23. Dans ces cellules, LLT1 aide à maintenir l'auto-tolérance des cellules NK10,23. Cependant, l'IL-2 peut induire son expression sur les cellules NK et T24. De plus, LLT1 est régulé à la hausse sur le glioblastome25, le cancer de la prostate et du sein triple négatif26,27 et les lymphomes non hodgkiniens à cellules B28, dans lesquels LLT1 contribue à l'évasion immunitaire en atténuant la cytotoxicité des cellules NK. Fait intéressant, un nombre accru de cellules CD161+ Th17 a été détecté dans les tumeurs du gliome29. Parallèlement, les fonctions des récepteurs NKR-P1 sur les cellules T régulatrices productrices d'IL-1730, sur des sous-ensembles de cellules Tc1731 et sur toutes les cellules Th1719 sont particulièrement pertinentes car ces cellules ont été impliquées dans plusieurs maladies auto-immunes (maladie de Crohn32, sclérose en plaques33, polyarthrite rhumatoïde34 et psoriasis35). Par conséquent, l'analyse des récepteurs NKR-P1 et des ligands tels que LLT1 est essentielle pour mieux comprendre les relations structure-fonction sous-jacentes aux processus physiologiques et pathogènes du système immunitaire.

NKR-P1 et LLT1 humains sont des glycoprotéines transmembranaires de type II avec une topologie protéique similaire4 : une queue de signalisation cytoplasmique N-terminale, une hélice transmembranaire, une région de tige flexible et un domaine de type lectine de type C C-terminal (CTLD)3, 7,36. De plus, il a été démontré que NKR-P1 et LLT1 forment des homodimères disulfure7,36, probablement liés dans leurs régions de tige. Cependant, la structure du complexe NKp65:KACL37 est la seule parmi tous les complexes de la sous-famille des récepteurs humains de type lectine de type C (CTL): ligand qui ait été résolue jusqu'à présent. Une étude ultérieure a en outre montré que l'interaction entre NKp65 et KACL est basée sur les protéines et indépendante de la glycosylation38. Sur la base de ces données, un modèle du complexe NKR-P1:LLT1 a ensuite été proposé et les résidus d'interaction clés ont été identifiés par analyse par résonance plasmonique de surface (SPR) des mutants NKR-P1 et LLT1, soulignant la cinétique rapide de cette interaction39,40 . De plus, les structures de l'ectodomaine NKR-P1B de souris apparenté complexé avec la protéine m12 d'immunoévasine du cytomégalovirus murin (MCMV), ou avec son ligand apparenté Clrb, ont été récemment rapportées41,42. Auparavant, nous avons signalé la première structure de LLT143 formant un dimère non covalent indépendamment de la glycosylation44 et suivant le mode de dimérisation conservé des ligands codés par CLEC2 observé pour CD6945,46 et Clrg47. Néanmoins, aucun modèle complet de l'interaction dimère:dimère des complexes CTLR:ligand, correspondant à l'état naturel de ces protéines lorsqu'elles sont exprimées à la surface des cellules, n'est encore disponible.

Ici, nous étudions la structure de NKR-P1 humain et examinons les effets de la dimérisation de NKR-P1 sur la liaison de LLT1. Nous présentons la structure cristalline de NKR-P1 en complexe avec LLT1, expliquons les observations précédentes d'interaction en solution et montrons un nouvel assemblage de ce complexe utilisant deux sites de liaison non symétriques différents sur LLT1. Nos résultats expliquent comment le récepteur NKR-P1 humain surmonte sa faible affinité pour LLT1 par la réticulation et le regroupement induits par la liaison du ligand et élucident le mode de transduction du signal de ce récepteur dans la synapse immunitaire des cellules NK, fournissant ainsi un bon modèle pour la description future de complexes homologues de faible affinité apparentés.

Deux structures cristallines de l'ectodomaine NKR-P1 humain ont été résolues : la structure du NKR-P1 glycosylé possédant des N-glycanes Asn-GlcNAc2Man5 uniformes (NKR-P1_glyco) et du NKR-P1 déglycosylé avec des N-glycanes clivés après le premier résidu GlcNAc (NKR-P1_deglyco); les données statistiques sur toutes les structures sont décrites dans le tableau 1. NKR-P1 dans les deux structures cristallines suit la caractéristique générale de pli d'un domaine CTL - deux hélices α (α1 et α2) et deux feuillets β antiparallèles avec le motif WIGL hydrophobe conservé à l'intérieur le cœur du domaine (Figs. 1 et 2a). Les deux feuillets β sont formés par les brins β β0, β1, β1' et β5, et β2, β2′, β3 et β4, respectivement (affectation selon Zelensky et Gready5, également utilisée pour décrire d'autres structures CTL apparentées37,40 ). De plus, trois liaisons disulfure intramoléculaires stabilisent le domaine : Cys94-Cys105, Cys122-Cys210 et Cys189-Cys202.

Les éléments de structure secondaire et les régions de boucle (L) sont désignés pour NKR-P1 et LLT1 au-dessus des alignements. Les nombres appariés en bas indiquent les paires de disulfure dans les structures NKR-P1 et LLT1 ; les astérisques marquent la mutation His176Cys dans LLT1 et le résidu Ile168 dans NKR-P1. Les sites de N-glycosylation prédits de NKR-P1 et LLT1 sont indiqués par des triangles orange. Les motifs WIGL conservés sont soulignés en noir. Les lignes bleues au-dessus de la séquence indiquent les régions formant les dimères non covalents de NKR-P1 ou LLT1. Les résidus conservés sont marqués en rouge ; les lettres en gras désignent des résidus strictement conservés. a Alignement de séquences de CTLD de récepteurs de cellules NK apparentés à NKR-P1 humains, c'est-à-dire NKR-P1, NKp65 et NKp80 humains. Les résidus NKR-P1 en contact avec LLT1 dans le complexe NKR-P1:LLT1 dans le mode de liaison primaire, et les résidus NKp65 en contact avec KACL dans le complexe NKp65:KACL, sont surlignés en vert. Les triangles violets indiquent les résidus NKR-P1 qui engagent LLT1 dans le complexe NKR-P1:LLT1 dans le mode de liaison secondaire. b Alignement des séquences des CTLD des ligands CLEC2 humains apparentés à LLT1, c'est-à-dire LLT1, KACL et AICL. Les résidus LLT1 en contact avec NKR-P1 dans le complexe NKR-P1:LLT1 dans le mode de liaison primaire, et les résidus KACL en contact avec NKp65 dans le complexe NKp65:KACL, sont surlignés en vert. Les triangles violets indiquent les résidus LLT1 qui engagent NKR-P1 dans le complexe NKR-P1:LLT1 dans le mode de liaison secondaire. L'alignement a été effectué dans Clustal Omega83 et les graphiques ont été préparés dans ESPript 3.084.

un diagramme en ruban du NKR-P1 CTLD. Les éléments de la structure secondaire sont étiquetés de différentes couleurs : l'hélice α1 est rouge, l'hélice α2 est jaune et les brins β et les boucles sont cyan. b Comparaison entre les dimères NKR-P1 formés par les formes glycosylées (cyan), libres déglycosylées (vert) et liées à LLT1 (bleu) de NKR-P1. c Comparaison entre la dimérisation centrée sur les hélices α1 et α2 de la dectine-1 murine (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb, magenta) et la LLT1 humaine (https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb , vert), respectivement ; les hélices α1 et α2 sont représentées en rouge et jaune. Les alignements structuraux des homodimères dectine-1 et NKR-P1 et des homodimères LLT1 et NKR-P1, préparés en alignant un seul monomère de chaque dimère, sont indiqués sur le côté droit. Bien que le pli CTLD soit conservé dans chaque paire de monomères alignés, les dimères centrés sur l'hélice α1 et l'hélice α2 présentent un arrangement inverse.

L'unité asymétrique de NKR-P1_glyco contient deux monomères, tandis que l'unité asymétrique de NKR-P1_deglyco contient huit monomères NKR-P1. Tous ces monomères sont disposés en homodimères très similaires, avec des RMSD par paires sur les atomes Cα jusqu'à 0, 5 Å (Fig. 2b). Cependant, ces homodimères ont une configuration inattendue : ils ne suivent pas le mode de dimérisation habituel observé pour les CTLD des ligands CLEC2 tels que CD69 ou LLT1 avec l'hélice α2 à l'interface de dimérisation. Au lieu de cela, l'interface de dimérisation de NKR-P1 est formée par l'hélice α1, comme dans le récepteur murin de reconnaissance de formes de type lectine de type C dectine-1 (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb)48, avec lequel NKR-P1 humain ne partage que 32% d'identité de séquence du CTLD (Fig. 2c). La RMSD des atomes Cα entre les dimères NKR-P1 et dectine-1 est de 3,7 Å dans la région de chevauchement (correspondant à 196 des 250 résidus totaux du dimère NKR-P1). La région structurellement distincte couvre principalement les hélices α2, dont les positions diffèrent jusqu'à 7 Å entre NKR-P1 et dectine-1. Nous avons également observé un arrangement très similaire avec l'interface de dimérisation centrée sur l'hélice α1 dans la structure d'un dimère disulfure covalent de l'ectodomaine du récepteur NKR-P1B du rat (https://doi.org/10.2210/pdb5J2S/pdb)49 avec 1,4 Å RMSD de les atomes Cα entre ces deux dimères (Fig. 1a supplémentaire). Au contraire, le dimère non classique de souris NKR-P1B (https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42 a une disposition globale entièrement différente (Fig. 2a supplémentaire).

L'interface de dimérisation de l'homodimère NKR-P1 consiste en six liaisons protéine-protéine et plusieurs liaisons hydrogène médiées par l'eau (tableau supplémentaire 1), une interaction de liaison peptidique via des électrons délocalisés (Lys126-Glu127) et un petit noyau hydrophobe comprenant Leu119, Ala120 , et Ile168 des deux chaînes (Fig. 3). La surface de contact est d'env. 500 Å2. Comparé au dimère LLT1 centré en hélice α2 (7–12 liaisons hydrogène, noyau hydrophobe plus fort, surface de contact de 500–800 Å2)43, le dimère NKR-P1 centré en hélice α1 se forme à travers une surface de contact plus petite avec moins de résidus de contact .

a Dimerization interface of human NKR-P1. Subunits of human NKR-P1 are shown as Cα-trace (blue and cyan), and the dimer contact residues are shown as sticks with carbon atoms colored in light blue (blue subunit) and orange (cyan subunit); for clarity, only the residues of the blue subunit are labeled. The first GlcNAc unit N-linked to Asn116 and the carbohydrate chain N-linked to Asn169, observable in the NKR-P1_glyco structure, are shown with carbon atoms colored yellow and green, respectively. b Top view of the dimerization interface. The NKR-P1 subunits surfaces are colored blue and cyan. The GlcNAc units bound to Asn116 are shown as sticks with carbon atoms in yellow. Contact residues between the GlcNAc bound to chain A, and the chain B, are shown in yellow, whereas contact residues between the GlcNAc bound to chain B, and the chain A, are shown in purple. Hydrogen bonds are shown as green-dashed lines with a detailed view on the right-hand side. c Mixed glycosylation states at the dimer interface in the NKR-P1_deglyco structure. The GlcNAc unit N-linked to Asn157 of chain A is modeled with an occupancy of 0.5, while the second GlcNAc unit present at Asn116 of chain B is not modeled. Contours of 2mFo-DFc (2.8σ, cyan) and mFo-DFc (1σ, green) electron density maps are shown. d Small hydrophobic core in the central part of the NKR-P1 dimerization interface (subunits colored as in (a)). The central residues are shown as spheres with carbon atoms in yellow. The carbon atoms of Ile168 residues (whose mutation decreases the ability of NKR-P1 to bind LLT1)C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e2666">51 sont représentés en orange.

L'ectodomaine NKR-P1 contient trois sites potentiels de N-glycosylation au niveau des résidus Asn116, Asn157 et Asn169 (Fig. 1a). La glycosylation à Asn169 est visible dans les cartes de densité électronique des structures NKR-P1_glyco et _deglyco. Dans NKR-P1_glyco, la chaîne glucidique complète GlcNAc2Man5 est localisée dans la chaîne A, tandis qu'une chaîne partielle GlcNAc2Man3 est localisée dans la chaîne B (Fig. 3a). Dans NKR-P1_deglyco, une seule unité GlcNAc restant à Asn169 peut être bien identifiée dans les huit chaînes NKR-P1. Fait intéressant, les premières unités GlcNAc localisées liées à Asn116 dans NKR-P1_glyco et les unités GlcNAc qui se chevauchent à Asn116 et Asn157 restant dans NKR-P1_deglyco participent aux contacts de dimérisation avec les résidus des hélices α1 et les régions β2, L1 et β2 'de la sous-unité opposée de l'homodimère NKR-P1 (Fig. 3b). Dans NKR-P1_glyco, cinq liaisons hydrogène entre Asn116: GlcNAc et la sous-unité opposée stabilisent l'homodimère centré sur l'hélice α1 (tableau supplémentaire 1). La surface de contact entre la chaîne opposée de NKR-P1 et l'unité GlcNAc localisée est d'environ 125 Å2.

Dans NKR-P1_deglyco, la densité à l'interface homodimère peut accueillir l'unité GlcNAc restante de l'Asn116 d'une chaîne ou de l'Asn157 de la chaîne opposée du dimère NKR-P1 (pour plus de détails, voir Méthodes, Tableau 1 et Fig. 3c). Inversement, dans NKR-P1_glyco, la première unité GlcNAc à Asn116 est bien définie en densité électronique dans les deux chaînes, A et B, du dimère NKR-P1, alors qu'aucune densité électronique n'a été trouvée pour la glycosylation à Asn157. Cela suggère que bien que la glycosylation sur Asn116 ou Asn157 puisse contribuer à la formation de dimères, la dimérisation pourrait être altérée par un encombrement stérique si les deux N-glycanes sont présents simultanément. Pour tester cette hypothèse, nous avons exprimé le mutant NKR-P1 S159A, abrogeant ainsi la glycosylation sur Asn157. Le pli global du mutant est comparable au NKR-P1 de type sauvage, tel qu'évalué par spectroscopie CD (Fig. 3a supplémentaire). En effet, lorsqu'elle a été analysée par ultracentrifugation analytique, la protéine mutante présentait des niveaux substantiels d'espèces oligomères (Fig. 3b supplémentaire), alors que l'ectodomaine NKR-P1 de type sauvage est purement monomérique50. Ainsi, l'hétérogénéité de glycosylation peut affecter la propension du NKR-P1 humain à se dimériser et, par conséquent, sa capacité à former des complexes multimériques avec LLT1.

La structure cristalline du complexe NKR-P1:LLT1 est formée par les ectodomaines NKR-P1 et LLT1 déglycosylés. L'unité asymétrique du cristal contient un complexe de NKR-P1 dimère avec LLT1 dimère et un dimère supplémentaire de NKR-P1 (Fig. 4a). Ces dimères NKR-P1 ont la même interface de dimérisation centrée sur α1 en hélice que les structures des dimères NKR-P1 non liés décrits ci-dessus (Fig. 2b). Le dimère LLT1 conserve le mode de dimérisation centré sur l'hélice α2 attendu (Fig. 2c), identique à celui décrit précédemment dans les structures LLT1 non liées43. LLT1 a des unités GlcNAc clairement identifiables au niveau des résidus Asn95 et Asn147. La glycosylation NKR-P1 observée dans la densité électronique du complexe correspond à la glycosylation identifiée dans la structure NKR-P1_deglyco.

a L'organisation globale de la structure cristalline complexe. Le dimère LLT1 (vert/citron) entre en contact avec le dimère NKR-P1, formé par les monomères bleu et cyan. Le deuxième dimère NKR-P1 bleu-cyan est lié au premier par symétrie cristalline. Le monomère NKR-P1 cyan interagit avec LLT1 dans le mode d'interaction primaire, tandis que le monomère NKR-P1 bleu engage LLT1 en utilisant l'interface d'interaction secondaire. Un astérisque noir marque le contact accessoire mutuel de NKR-P1 lié en mode primaire et secondaire. De plus, l'unité asymétrique du cristal contient un autre dimère NKR-P1 (rose/magenta) sans contact avec LLT1. b Comparaison globale de la structure du dimère KACL (violet) en complexe avec deux monomères NKp65 (rouge ; https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb) et de la structure du dimère LLT1 (vert/citron) avec les deux molécules NKR-P1 interagissant dans les modes de liaison primaire (cyan, côté gauche) et secondaire (bleu, côté droit). La comparaison avec uniquement les modes d'interaction primaire ou secondaire NKR-P1:LLT1 est mise en évidence dans la section inférieure (les deux dans une vue latérale, en utilisant une rotation de l'axe y de 90°). c, d Interfaces d'interaction primaire et secondaire NKR-P1:LLT1. Les résidus de contact à moins de 5 Å de distance sont colorés en jaune. Les acides aminés formant les quatre contacts les plus forts sont surlignés en rouge pour le mode primaire ou en magenta pour le mode secondaire.

L'homodimère LLT1 engage son partenaire de manière bivalente, c'est-à-dire qu'un dimère interagit avec deux dimères NKR-P1 liés par symétrie cristallographique : chaque monomère LLT1 se lie à une sous-unité différente d'un homodimère NKR-P1 distinct (Fig. 4a). Il n'y a pas d'ajustement induit apparent des partenaires de liaison - la RMSD des atomes Cα entre les dimères NKR-P1 non interagissants et interagissants (NKR-P1_glyco et le complexe) est de 0,5 Å, et celle de LLT1 (https://doi .org/10.2210/pdb4QKI/pdb et le complexe actuel) est de 0,7 Å. De plus, les chaînes de glycosylation N-liées ne contribuent pas directement à l'interaction.

NKR-P1 et LLT1 établissent deux types de contact dans cette structure - les modes d'interaction primaire (LLT1 chaîne B:NKR-P1 chaîne D) et secondaire (LLT1 chaîne A:NKR-P1 chaîne liée à la symétrie C). Le mode d'interaction primaire correspond bien à la structure du complexe humain homologue NKp65:KACL (https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb)37 – la RMSD des atomes Cα des deux complexes est de 1,3 Å (une chaîne du récepteur et une chaîne du ligand dans chaque cas, Fig. 4b, en bas à gauche). De même, dans la structure du NKR-P1B de souris complexé avec l'immunoévasine MCMV m12, l'interface d'interaction observée correspond au mode primaire dans la structure actuelle du complexe NKR-P1 humain, bien que la zone couverte par la protéine m12 soit considérablement plus grande (Fig. 1b, c)41. La structure récemment décrite du complexe NKR-P1B:Clrb de souris (https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42 a également montré une interface d'interaction commune aux deux récepteurs NKR-P1 (Fig. 2b, c supplémentaires). Cependant, l'arrangement récepteur: ligand observé dans le deuxième mode d'interaction du complexe NKR-P1: LLT1 est unique et diffère de tous les complexes homologues connus dans l'orientation du ligand (Fig. 4b, en bas à droite et Fig. 2b supplémentaire).

Les interfaces d'interaction du NKR-P1 humain impliqué dans les modes d'interaction primaire et secondaire sont très similaires. Ils sont formés principalement par des résidus membranaires-distaux des boucles L0, L3, L5 et L6 et par des brins β3 et β4 (Fig. 4c, d), créant une surface plane pour l'interaction avec LLT1. En revanche, dans LLT1, les interfaces d'interaction primaire et secondaire sont sensiblement différentes, bien qu'elles partagent un petit nombre de résidus. Alors que les boucles L0 ', L0, L3, L5, L6 et les brins β3 et β4 forment le patch d'interaction primaire de LLT1 (Fig. 4c), les résidus des boucles L2 et L5, le brin β2 "et l'hélice α2 sont impliqués dans le deuxième interface d'interaction (Fig. 4d) Les deux modes d'interaction placent les parties proximales de la membrane du récepteur et du ligand sur les côtés opposés du complexe, créant un modèle plausible d'interaction entre deux cellules voisines.

Le mode d'interaction principal est établi par neuf liaisons hydrogène directes et plusieurs liaisons hydrogène médiées par l'eau, en plus de deux interactions supportées par la charge et d'empilement π-π (Tyr201-Arg175), avec une surface de contact totale d'environ. 800 Å2 (tableau supplémentaire 1). Les quatre liaisons les plus fortes se produisent entre les résidus NKR-P1 Arg181, Tyr201, Lys148 et Ser199 et les résidus LLT1 Glu179, Glu162, Ser129 et Tyr177, respectivement (Fig. 4c). Le deuxième mode d'interaction est établi par cinq liaisons hydrogène directes, deux supportées par la charge et une interaction hydrophobe (LLT1: Pro156 - NKR-P1: Ala149, Leu151), avec une surface de contact totale d'environ. 550 Å2 (tableau supplémentaire 1). Les trois liaisons les plus fortes se produisent entre les résidus NKR-P1 Asp147, Ser199 et Arg181 et les résidus LLT1 Arg153, Lys169 et Asn120, respectivement (Fig. 4d).

Outre l'interaction avec LLT1, les dimères NKR-P1 liés en modes primaire et secondaire ont également un contact accessoire mutuel non négligeable (chaîne D de NKR-P1 et chaîne C de NKR-P1 en position liée à la symétrie, Csym). La zone d'interface a 440 Å2 et est établie par sept liaisons hydrogène directes (tableau supplémentaire 1). Quatre résidus dominent l'interface : Asn143 et Arg146 de la chaîne D et Asn174 et Asn176 de la chaîne Csym (aucun des résidus d'asparagine n'est un site de glycosylation). L'interface a également plusieurs contacts à médiation par l'eau.

Pour caractériser la taille et la forme du complexe NKR-P1:LLT1 en solution, nous avons effectué une ultracentrifugation analytique (AUC), une thermophorèse à micro-échelle (MST) et une diffusion de rayons X aux petits angles couplée à une chromatographie d'exclusion de taille (SEC-SAXS ) expériences. Les données AUC acquises dépendent de la concentration et reflètent la nature dynamique de ce système en interaction, similaire aux résultats des mesures SEC-SAXS. L'ectodomaine NKR-P1 humain libre est monomérique, avec un coefficient de sédimentation s20,w de 2,1 S correspondant à une masse moléculaire estimée de 18 kDa, correspondant étroitement à la valeur attendue de 17,5 kDa. L'ectodomaine LLT1 forme un dimère stable non covalent (2,9 S) qui ne se dissocie pas en monomères, sauf à très faible concentration, comme précédemment caractérisé43,50. Lors de l'augmentation de la concentration de chargement du mélange équimolaire NKR-P1: LLT1, le coefficient de sédimentation du complexe augmente également, atteignant une valeur s20,w de 3,7 S à la concentration analysée la plus élevée (Fig. 3c supplémentaire). Cette valeur, une fois corrigée de la non-idéalité causée par la concentration de charge protéique élevée utilisée (18 mg/ml), correspond à une valeur estimée du coefficient de sédimentation à concentration nulle en protéines s020,w de 4,5 S, et à une particule modérément allongée avec environ dimensions de 10–15 × 4–5 × 4–5 nm. Cela se compare bien aux dimensions de 8–10 × 5–6 × 4–5 nm attendues pour les possibles assemblages d'interaction NKR-P1:LLT1 observés dans la structure cristalline du complexe, c'est-à-dire monomère:dimère:monomère ou dimère:dimère (notez que alors que les chaînes N-glycanes ne sont pas présentes dans la structure du complexe déglycosylé, elles étaient présentes lors de toutes nos analyses en solution).

Pour comprendre si le mode d'interaction secondaire observé dans la structure cristalline est également utilisé dans la solution, nous avons conçu un triple mutant N120R, R153E, K169A de LLT1 (LLT1SIM), supprimant ainsi les trois contacts les plus forts dans l'interface d'interaction secondaire LLT1 (Fig. 4d). Le mutant LLT1SIM a été exprimé et purifié de la même manière que le LLT1 de type sauvage et a affiché un spectre CD comparable (Fig. 3a supplémentaire). La série de concentration du mélange équimolaire NKR-P1:LLT1SIM a atteint une valeur s20,w de 3,3 S (correspondant à une valeur s020,w estimée de 3,9 S), montrant clairement la formation du complexe d'une taille plus petite par rapport au NKR de type sauvage -P1: mélange LLT1, éventuellement un assemblage monomère: dimère (Fig. 3d supplémentaire). En intégrant l'ensemble des courbes c(s) de distribution de taille continue et en traçant les valeurs S moyennes en poids résultantes par rapport aux concentrations de protéines LLT1 utilisées, des isothermes de liaison ont été construits pour les deux séries de dilution et tout d'abord mieux adaptés au modèle de liaison d'hétéro-association le plus simple. A + B ⇔ AB, où A est le dimère LLT1 et B est le monomère NKR-P1 (Fig. 4a supplémentaire). LLT1SIM a montré une affinité globale environ trois fois plus faible que le LLT1 de type sauvage, ce qui a été corroboré par une analyse MST indépendante utilisant du NKR-P1 marqué par fluorescence titré avec LLT1 ou LLT1SIM (Fig. 4b supplémentaire). Pour analyser la différence entre LLT1 de type sauvage et LLT1SIM concernant la liaison du deuxième monomère NKR-P1, nous avons également ajusté au mieux les données en utilisant le modèle A + B ⇔ AB + B ⇔ BAB (Fig. 4c supplémentaire). Alors que pour le LLT1 de type sauvage, cela améliorait l'ajustement et fournissait deux valeurs KD différentes, correspondant éventuellement aux modes d'interaction primaire et secondaire, pour LLT1SIM, les valeurs KD ajustées restaient inchangées, réfutant la liaison du deuxième monomère NKR-P1. De même, lorsque les données AUC et MST ont été globalement ajustées avec les paramètres AUC fixés aux valeurs précédemment les mieux ajustées, les données LLT1SIM MST ont pu être ajustées aussi bien avec les modèles AB et BAB. En revanche, l'ajustement est médiocre pour le modèle AB dans le cas du LLT1 de type sauvage (Fig. 4d supplémentaire). Pris ensemble, nos données montrent que l'interface d'interaction secondaire n'est pas seulement un contact cristallin, mais contribue de manière significative à l'affinité globale de l'interaction NKR-P1:LLT1.

L'observation d'assemblages d'ordre encore plus élevé est peu probable dans l'expérience de vitesse de sédimentation AUC, étant donné la cinétique rapide de cette interaction, la longue échelle de temps de l'expérience et le fait que la concentration en protéines diminue régulièrement le long de la limite de sédimentation. Cependant, la structure cristalline du complexe NKR-P1:LLT1 suggère un arrangement en chaîne de dimères récepteur:ligand. Pour déterminer si de tels assemblages existent dans la solution, nous avons effectué une analyse SEC-SAXS du mélange équimolaire NKR-P1:LLT1 à une concentration de charge de 15 mg/ml. Deux pics d'absorbance à 280 nm, correspondant à deux pics SAXS distincts, ont été observés dans l'expérience SEC-SAXS (Fig. 5). Pour une analyse plus approfondie, nous avons échantillonné quatre intervalles de données à partir du premier pic et deux intervalles de données à partir du deuxième pic et fusionné séparément les données à l'intérieur de ces intervalles (Fig. 5 et Fig. 5 supplémentaire). Le rayon de giration calculé à partir du signal SAXS diminue régulièrement avec le volume de rétention. Deux petits plateaux dans le pic principal suggèrent un équilibre dynamique entre la formation de complexes et la dissociation (Fig. 5). En conséquence, les courbes de diffusion fusionnées n'ont pas pu être bien ajustées aux courbes de diffusion simulées à partir d'une seule structure du complexe NKR-P1: LLT1 ou de ses composants. Par conséquent, nous avons construit des modèles d'assemblages du complexe NKR-P1:LLT1 de longueurs variables (nombre de chaînes protéiques), en considérant toutes les permutations possibles de l'ordre des molécules en utilisant uniquement les modes d'interaction primaire, uniquement secondaire ou les deux en alternance. . La bibliothèque résultante de tous ces modèles (au total, 49 structures différentes) a ensuite été utilisée par le logiciel OLIGOMER pour ajuster au mieux les intervalles de données échantillonnés (Fig. 5 supplémentaire) ainsi que les courbes expérimentales SAXS individuelles (Données supplémentaires 1). Par cette approche, les données SAXS échantillonnées correspondent raisonnablement bien aux courbes de diffusion calculées superposées de groupes de structures complexes NKR-P1:LLT1 de stoechiométrie plus élevée (χ2 1,29–3,47 ; notez que la glycosylation complète n'a pas été modélisée, mais elle a contribué à la diffusion ; Figure supplémentaire 5). Suite au rayon de giration décroissant continuellement calculé à partir des données SAXS, la stoechiométrie des structures les mieux ajustées du complexe NKR-P1: LLT1 diminue également constamment avec le volume de rétention. La courbe de diffusion SAXS du premier pic est la mieux adaptée avec deux à trois dimères LLT1 interagissant dans un oligomère en forme de chaîne avec deux à trois dimères NKR-P1, la courbe du deuxième pic à un dimère LLT1 interagissant avec un NKR-P1 dimère en mode primaire ou secondaire. Notamment, OLIGOMER a généralement privilégié les assemblages qui combinent les modes d'interaction primaires et secondaires contre les modèles avec les modes primaires ou secondaires seuls.

Superposition du profil de chromatographie d'exclusion de taille (ligne noire) et du signal de diffusion SAXS (ligne rouge) pour le mélange équimolaire NKR-P1:LLT1 à une concentration de charge de 15 mg/ml. Les deux signaux présentent deux pics distincts. Pour chaque image SAXS collectée, le rayon de giration a été calculé à l'aide d'AUTORG (cercles bleus). Pour une analyse plus approfondie, six intervalles des données SAXS ont été sélectionnés et fusionnés séparément (cadres 355–367, 368–378, 379–388, 389–399, 431–440, 481–491 ; désignés par des colonnes avec des hachures diagonales). La courbe de diffusion SAXS (a), le diagramme de Kratky (b) et la fonction de distribution de distance de paire (c) pour les intervalles 389–399 et 481–491 sont présentés dans l'encart pour l'évaluation de la qualité des données des données fusionnées. Les six intervalles de données fusionnés ont ensuite été analysés individuellement par OLIGOMER (Données supplémentaires 1 et Fig. 5 supplémentaires). Les données de diffraction de l'expérience SEC-SAXS ont été déposées (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j3.1)81.

Pour répondre à la pertinence biologique de ces complexes d'ordre supérieur dans le contexte d'une cellule vivante, nous avons réalisé des études de microscopie de localisation d'une seule molécule avec une lignée cellulaire exprimant NKR-P1 et quantifié la distribution de surface de NKR-P1 par rapport à LLT1 ou Liaison LLT1SIM. Les transfectants NKR-P1 de pleine longueur générés à l'aide du système piggyBac ont été induits pour exprimer le récepteur dans une densité limitée pour permettre la microscopie de localisation d'une seule molécule. Les cellules ont ensuite été incubées en présence ou en l'absence de LLT1 ou LL1SIM soluble, fixées et marquées avec un mAb anti-NKR-P1 AlexaFluor® 647. Des images de microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) ont été acquises et une analyse en grappes de tessellation de Voronoi a été utilisée pour évaluer l'effet de LLT1 soluble sur l'organisation à l'échelle nanométrique de NKR-P1 à la surface de la cellule (Fig. 6a). En l'absence de LLT1, nous avons détecté des clusters d'événements fluorescents avec une surface moyenne de 1870 ± 777 nm2 (Fig. 6b) et un diamètre moyen de 41 ± 7 nm (Fig. 6c), principalement des clusters d'événements avec un diamètre allant de 10 à 40 nm (Fig. 6d), indiquant les homodimères NKR-P1 doublement marqués AlexaFluor® 647 (erreur de liaison d'environ 6 nm + 10 nm pour chaque mAb ± 15 nm de précision de localisation ; veuillez noter que la taille apparente des amas fluorescents ne correspond pas directement à la taille des grappes de récepteurs). L'ajout de LLT1 soluble a augmenté de manière significative les diamètres des groupes d'événements observés (à 47 ± 6 nm ; p < 0,0001, Fig. 6c, d), la surface (2713 ± 1180 nm2 ; p < 0,0001, Fig. 6b) et la nombre d'événements détectés dans les clusters (38,8 ± 12,3 ; p <0,0001, Fig. 6e), alors que la densité d'événements dans les clusters est restée inchangée, comme prévu (Fig. 6f). De plus, l'effet de l'ajout de LLT1SIM sur l'organisation à l'échelle nanométrique de NKR-P1 était statistiquement impossible à distinguer du contrôle négatif tout en étant significativement différent de l'effet de l'ajout de LLT1. Sur la base de la comparaison relative de ces trois états de récepteurs distincts (libre, lié à LLT1 et lié à LLT1SIM), nous pouvons supposer que l'interface d'interaction secondaire dans LLT1 est nécessaire pour former des clusters NKR-P1 à l'échelle nanométrique lors de l'interaction. Aucune différence significative dans la densité totale des événements par surface cellulaire interne (zone évaluée) n'a été trouvée (Fig. 6g), indiquant des niveaux d'expression stables de NKR-P1 tout au long de la mesure. Par conséquent, la taille des nanoclusters NKR-P1 augmente (au-delà d'une unité d'homodimère) non pas à cause des différences dans les niveaux d'expression de NKR-P1 mais parce que LLT1 réticule deux homodimères NKR-P1 ou plus.

Les transfectants stables NKR-P1 ont été incubés en présence ou en l'absence de LLT1 ou LLT1SIM soluble, et la distribution de surface cellulaire de NKR-P1 a été contrôlée par microscopie à super-résolution. a Images représentatives en fond clair (BF) et dSTORM de transfectants stables NKR-P1 HEK293 pleine longueur sur des lames revêtues de PLL incubées sans (noir) ou avec LLT1 (rouge) ou LLT1SIM (vert), fixées et colorées avec AlexaFluor® 647 marqué mAb anti-NKR-P1; les barres d'échelle représentent 5 µm. Les régions de 10 µm2 (boîtes rouges dans les images dSTORM) sont agrandies et affichées avec des grappes correspondantes de cartes d'événements fluorescents (CoE) et de cartes binaires ; les barres d'échelle représentent 1 µm. b–g Analyse des changements relatifs de distribution de NKR-P1 sur toute la longueur induits par la présence de ses ligands solubles LLT1 ou LLT1SIM : zone moyenne des grappes d'événements (b), diamètres moyens des grappes d'événements (c), distributions de taille des grappes d'événements diamètres superposés aux fonctions de distribution de Poisson (d), événements moyens par groupe d'événements (e), densité d'événements détectés par groupe d'événements (f) et densité totale des événements détectés (g). En b, c et e, f, chaque point tracé représente la valeur moyenne obtenue à partir de l'analyse de la surface interne totale d'une seule cellule. Le centre de la boîte à moustaches représente la valeur moyenne globale, les limites de la boîte représentent l'intervalle interquartile et les moustaches représentent ± SD. Les données proviennent de n = 45 cellules témoins NKR-P1+ et n = 41 ou n = 47 cellules NKR-P1+ incubées avec LLT1 ou LLT1SIM dans sept ou quatre expériences indépendantes, respectivement. ANOVA unidirectionnelle avec correction de Bonferroni, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, ns. insignifiant. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ensuite, nous avons analysé l'effet de LLT1 ou LLT1SIM soluble sur le potentiel inhibiteur de NKR-P1 natif exprimé à la surface de cellules NK fraîchement isolées dans un test de cytotoxicité à médiation cellulaire NK, étudiant ainsi davantage l'influence de la liaison induite par le ligand NKR-P1. réticulation sur la signalisation cellulaire. Les cellules NK isolées du sang de trois donneurs sains différents ont été activées avec de l'IL-2 et mélangées avec les cellules cibles K562 dans un rapport de cellules effectrices: cibles de 40: 1 et incubées pendant 4 h avec du tampon PBS comme contrôle négatif ou avec le soluble LLT1 ou LLT1SIM (tous deux à deux concentrations différentes). En l'absence de ligand NKR-P1, les cellules K562 sont bien sensibles à la lyse médiée par les cellules NK (Fig. 7; contrôle PBS, moins de 10% de cellules K562 vivantes). Comme prévu, la lyse a été sensiblement bloquée en présence de LLT1 soluble. En revanche, la variante LLT1SIM avec une interface d'interaction secondaire mutée ne pouvait pas bloquer la cytotoxicité médiée par les cellules NK. Comme observé par dSTORM sur la surface cellulaire (Fig. 6), LLT1SIM ne réticule pas efficacement NKR-P1. Ce mutant ne parvient pas non plus à se signaler via la voie du récepteur inhibiteur NKR-P1. Par conséquent, sur la base des données de microscopie et de test de cytotoxicité, nous concluons que la réticulation de NKR-P1 déclenchée par la ligature de LLT1 est biologiquement pertinente et indispensable pour la signalisation cellulaire et nécessite une interaction dans les modes d'interaction primaire et secondaire.

Des cellules NK de trois donneurs différents (bleu, rouge et vert) et des cellules cibles K562 ont été incubées avec du tampon PBS uniquement (témoin négatif) ou avec les protéines solubles LLT1 ou LLT1SIM, à la fois à des concentrations de 50 et 250 µM correspondant aux valeurs 1× et 5 × valeurs KD, respectivement, telles qu'analysées par l'AUC pour le mode d'interaction primaire (cf. Fig. 4 supplémentaire). Les graphiques à barres représentent les moyennes des cellules K562 vivantes dans chaque condition avec les résultats des expériences individuelles tracées sous forme de cercles vides, et les moustaches représentent ± SD. Le cas échéant, les données ont été évaluées statistiquement par ANOVA unidirectionnelle. Considérant p < 0,05 comme statistiquement significatif, l'effet inhibiteur de LLT1 soluble diffère significativement de LLT1SIM, qui ne diffère pas de la condition témoin dépourvue de tout ligand NKR-P1. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Actuellement, il n'y a que deux complexes récepteurs de cellules NK CTL:CTL:ligand similaires avec une structure 3D connue : NKp65 humain:KACL37 et NKR-P1B:Clrb42 de souris. Ces complexes homologues sont topologiquement similaires au mode d'interaction primaire du complexe NKR-P1: LLT1 (Fig. 4b). L'identité de séquence de la partie extracellulaire de NKR-P1 avec NKp65 est de 33 % et avec NKR-P1B murin de 42 %. En comparaison, l'identité de séquence de la partie extracellulaire de LLT1 avec KACL est de 49 % et avec Clrb murin de 51 %. La structure du complexe humain NKp65:KACL comprend deux unités NKp65 monomères interagissant séparément et symétriquement avec un ligand dimère KACL. La structure cristalline du complexe murin NKR-P1B: Clrb montre deux dimères Clrb interagissant avec un dimère NKR-P1B placé entre eux (chaque dimère Clrb interagit avec l'une des deux chaînes NKR-P1B). L'arrangement du complexe murin est similaire à la structure du complexe NKR-P1: LLT1 présentée ici, mis à part le fait que le complexe murin est symétrique alors que nous observons deux interfaces de liaison distinctes, le mode d'interaction primaire et secondaire de LLT1.

Malgré différentes formes oligomériques des complexes NKR-P1:LLT1, NKR-P1B:Clrb et NKp65:KACL, l'interaction récepteur primaire:ligand est similaire dans les trois cas au niveau de la superposition monomère:monomère - la paire récepteur:ligand de les monomères se chevauchent essentiellement le long de toute la chaîne. Les régions les plus structurellement conservées sont généralement des feuillets β conservés séquentiellement au cœur des protéines. La figure 6a supplémentaire montre en rouge les fragments avec une position 3D conservée, un type d'acide aminé et une longueur d'au moins trois acides aminés. Ces critères sont remplis par ces fragments: dans les ligands - KCFYFS (dans les résidus LLT1 humains 85–90), NWT (95–97), WIGL (132–135), WKW (143–145) et WICSK (182–186) , et dans les récepteurs - WIGL (dans les résidus NKR-P1 humains 153–156) et ICQ (209–211). Par conséquent, il semble que pour leur interaction, l'orientation mutuelle de l'échafaudage du récepteur et du ligand soit plus importante que l'interface d'interaction réelle.

Nous avons noté seulement trois paires d'interactions d'acides aminés conservées dans l'interface d'interaction dans au moins deux des trois complexes homologues. Ils sont regroupés autour des résidus Tyr165-Tyr171-Phe148, Arg175-Arg181-Arg158 et Tyr177-Tyr183-Phe160 du ligand (tableau supplémentaire 2 et figure supplémentaire 6a). Les résidus d'arginine forment des liaisons hydrogène équivalentes dans les cas Clrb et KACL. Dans LLT1, l'arginine prend une conformation différente et forme une liaison hydrogène intramoléculaire avec Asn183. Le mode d'interaction principal dans NKR-P1: LLT1 repose principalement sur les contacts de la chaîne principale qui permettent une cinétique kon/koff rapide, corroborant ainsi les découvertes basées sur la SPR précédemment publiées39,40 et notre analyse AUC. Par conséquent, un complexe topologiquement similaire est formé dans les trois cas, bien que le mécanisme de reconnaissance intermoléculaire sous-jacent soit semi-indépendant du pli réel et de la composition en acides aminés (Fig. 6b supplémentaire). Cependant, le mode d'interaction secondaire est unique au complexe NKR-P1:LLT1 et ne se trouve pas dans les autres complexes apparentés.

Y. Li and coworkers reported that the orientation of NKp65 bound to its ligand precludes the putative α2-centered dimerization of NKp6537. Similarly, a hypothetical NKp65 α1-centered dimer is also implausible based on steric hindrance and the lack of stabilizing interactions. This observation contrasts with the α1-centered dimerization of NKR-P1 present in both its unbound and complexed crystal structure. Interestingly, the single-nucleotide polymorphism (SNP) c.503 T > C of the human KLRB1 gene, causing the substitution of isoleucine 168 for threonine in the NKR-P1 CTLD, was reported to have a 37% frequency of the Thr168 alleleC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3335">51. The authors showed that the Thr168 isoform of NKR-P1 has a lower affinity to LLT1 and a weaker inhibitory effect on NK cells. They proposed that Ile168 forms a part of the interaction interface between NKR-P1 and LLT1, directly affecting LLT1 recognition by NKR-P1C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3339"> 51. Cependant, la structure de l'homodimère NKR-P1 montre que Ile168 se trouve à l'interface de dimérisation plutôt qu'à l'interface d'interaction membrane-distale - plus précisément, dans une petite poche hydrophobe à l'intérieur de l'interface de dimérisation (Fig. 3d). Par conséquent, nous proposons que la substitution du résidu isoleucine non polaire par la thréonine polaire causée par c.503 T> C SNP affecte indirectement l'affinité de liaison car cette substitution déstabilise l'homodimère NKR-P1 centré sur α1. La glycosylation a souvent un impact significatif sur l'homooligomérisation des récepteurs, comme cela a été récemment mis en évidence pour, par exemple, le récepteur d'activation des cellules NK NKp3052. L'homodimérisation de NKR-P1 est également régulée par ses glycanes ; spécifiquement, les glycanes présents sur Asn116 et Asn157 (Fig. 3b). Les chaînes de glycanes centrales présentes au niveau de ces résidus contribuent partiellement à l'interface de dimérisation centrée sur α1, mais en même temps, les glycanes s'entrechoquent. En conséquence, la stabilité de l'homodimère NKR-P1 centré sur α1 est améliorée en supprimant la N-glycosylation sur Asn157, ne laissant que le glycane Asn116 à l'interface du dimère (Fig. 3b supplémentaire). Fait intéressant, un SNP c.470 A> G provoquant la mutation N157S est également répertorié dans la base de données des variations du génome humain. Cependant, la signification clinique de la mutation N157S n'a pas encore été étudiée, bien qu'elle puisse affecter de manière significative la signalisation NKR-P1 en stabilisant son état lié au ligand. L'état oligomérique du récepteur pourrait ainsi moduler l'affinité de liaison globale NKR-P1:LLT1. Le complexe NKp65:KACL se distingue par sa haute affinité (Kd ~ 0,67 nM)37 – ca. 3000× plus fort que celui de NKp80:AICL (Kd ~ 2,3 µM)9 et 70 000–130 000× que celui de NKR-P1:LLT1 (Kd ~ 48 µM39 ; cette étude 90 µM). En raison de l'affinité de liaison NKp65: KACL exceptionnellement élevée, toute interface de dimérisation centrée sur α1 ancestrale putative peut avoir été perdue dans NKp65. En revanche, les récepteurs NKR-P1 et NKp80 peuvent avoir évolué pour compenser leur faible affinité pour leurs ligands en utilisant la dimérisation centrée sur α1 et en permettant un effet d'avidité accru.

L'analyse SPR des mutants à un seul résidu des deux partenaires de liaison, réalisée par J. Kamishikiryo et mise à jour par S. Kita et leurs collègues sur la base de la structure LLT1 publiée39,40, a identifié plusieurs résidus clés de NKR-P1 et LLT1 essentiels à leur interaction. et a proposé plusieurs paires de résidus en interaction (tableau supplémentaire 3). Les résidus mutés qui ont eu des effets néfastes ou modérés sur la liaison dans ces études SPR se trouvent principalement dans l'interface d'interaction primaire (Fig. 1 et Tableau supplémentaire 3) - dans LLT1 : Tyr165, Asp167, Lys169, Arg175, Arg180 et Lys181, et dans NKR-P1 : Arg181, Asp183, Glu186, Tyr198, Tyr201 et Glu205. Cependant, les paires d'interaction proposées ne sont pas toujours en accord avec l'orientation mutuelle des deux protéines observées dans la structure cristalline actuelle du complexe NKR-P1:LLT1. Par exemple, les paires LLT1/NKR-P1 suggérées Tyr177/Tyr198 et Arg175/Glu200 correspondent bien à nos paires d'interactions observées LLT1:Tyr177:OH/NKR-P1:Ser199:O et LLT1:Arg175:N/NKR-P1:Glu200 :OE2, respectivement. D'autre part, l'appariement proposé de Glu179 de la boucle L6 de LLT1 avec Ser193 et ​​Thr195 de la boucle L5 de NKR-P1 ne ressemble qu'aux contacts de structure cristalline de Glu179 avec Arg181 (boucle L3) et Tyr198 (brin β4), situés près de NKR-P1 boucle L5. Contrairement aux études SPR, nous n'avons observé aucun contact entre Tyr165 et Phe152, bien que LLT1:Tyr165 soit utilisé dans l'interface principale et que Phe152 soit proche de la région d'interaction NKR-P1 L0. Enfin, nous ne pouvons pas confirmer la liaison directe suggérée entre LLT1:Lys169 et NKR-P1:Glu205. Bien que ces résidus soient proches les uns des autres dans le mode primaire (la distance la plus proche de 4,3 Å), ils ne forment clairement pas une liaison pivot dans l'interface d'interaction. De plus, la chaîne latérale Lys169 est plutôt flexible, comme le suggère la faible qualité de sa carte de densité électronique dans le mode primaire, contrairement à toutes les autres chaînes latérales proches avec des positions bien définies.

Étant donné que le mode de liaison secondaire observé dans la structure NKR-P1: LLT1 implique une région de LLT1 différente de la région utilisée dans le mode de liaison primaire, l'orientation de LLT1 et NKR-P1 dans ce mode de liaison ne correspond pas aux paires d'interaction proposées dans les études SPR. Néanmoins, l'interface d'interaction NKR-P1 est très similaire dans les modes primaire et secondaire ; par conséquent, certains des résidus d'interaction NKR-P1 précédemment proposés sont également impliqués dans le mode secondaire (Arg181, Asp183, Tyr198 et Tyr201). Fait intéressant, le résidu LLT1:Lys169 établit plusieurs contacts avec NKR-P1 (Arg181, Ser199 et Glu200) en mode d'interaction secondaire. Cependant, la paire Lys169 / Glu20539,40 précédemment proposée n'est pas non plus observée dans ce mode, et ces résidus sont encore plus éloignés - environ 11 Å. La présence de Lys169 dans les interfaces d'interaction primaire et secondaire de LLT1 suggère que ce résidu joue un rôle important dans la formation globale du complexe. En conséquence, la mutation LLT1 précédemment rapportée Lys169Glu39,40 conduirait à une co-localisation de plusieurs chaînes latérales négatives dans l'interface secondaire (Glu200 et Asp183 de NKR-P1, et Glu169 muté de LLT1), indiquant ainsi que la perturbation de la NKR L'interaction -P1:LLT1 observée dans les expériences SPR précédentes résulte très probablement de l'affaiblissement de l'interface secondaire plutôt que primaire. J. Kamishikiryo a ensuite restauré la liaison en introduisant la mutation Glu205Lys dans NKR-P1. D'après notre structure, cet effet s'expliquerait par un renforcement de l'interface primaire. Ainsi, les données d'interaction basées sur la SPR précédemment publiées concordent largement avec les modes d'interaction observés entre NKR-P1 et LLT1 dans la structure cristalline actuelle, bien que certaines paires d'interaction précédemment suggérées aient été mal attribuées et ne soient présentes dans aucune des interfaces d'interaction.

Plusieurs auteurs ont précédemment suggéré un effet d'avidité de la multimérisation sur l'interaction qui compense la faible affinité du complexe NKR-P1:LLT137,40,47. Fait intéressant, dans la structure actuelle de ce complexe, nous observons en effet la formation d'une chaîne d'homodimères répétés NKR-P1 et LLT1. Ce multimère pseudo-linéaire a une forme en zigzag dans laquelle les parties proximales de la membrane des deux protéines sont sur des côtés opposés (Fig. 8), et il est structurellement basé sur les homodimères NKR-P1/LLT1 centrés en hélice alternée α1/α2. (l'effet de formation de chaîne) et l'implication simultanée des modes d'interaction primaires et secondaires (effet stérique). Au contraire, un modèle multimérique construit artificiellement de NKR-P1: LLT1 engagé uniquement dans le mode primaire montre une chaîne d'homodimères avec une conformation non linéaire, presque hélicoïdale (Fig. 6c supplémentaire). En outre, les régions de tige NKR-P1 s'opposent stériquement et les régions de tige LLT1 sont exposées à l'extérieur du noyau complexe dans de nombreuses directions différentes. Ainsi, un tel multimère est peu compatible avec l'ancrage et la formation de la membrane cellulaire dans la synapse immunitaire. NKR-P1: LLT1 engagé uniquement en mode secondaire formerait également un multimère hélicoïdal avec des régions de tige de récepteur et de ligand pointant dans de nombreuses directions différentes à l'extérieur du noyau complexe (Fig. 6d supplémentaire). Dans le même temps, lorsqu'elles sont liées au dimère LLT1 en mode d'interaction primaire et secondaire, les molécules NKR-P1 voisines créent un contact accessoire mutuel d'une contribution énergétique non négligeable à la stabilité de l'ensemble (Fig. 4a, marqué d'un étoile Noire). Ce contact accessoire englobe un nombre de liaisons hydrogène et une taille similaires à ceux de l'interface de liaison secondaire entre NKR-P1 et LLT1 elle-même (Fig. 6e supplémentaire), et il pourrait donc être considéré comme un élément stabilisant supplémentaire favorisant une combinaison de la liaison primaire et secondaire. modes plutôt qu'un seul d'entre eux.

a Representation of four adjacent asymmetric units within the NKR-P1:LLT1 complex crystal, excluding the additional unrelated NKR-P1 dimer. The NKR-P1 (blue and cyan) and LLT1 (green and lemon) dimers alternate in primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) interactions, forming a chain-like structure. The schematic depiction of this arrangement is shown in the inset with the same color code. The black and white triangles represent N-termini positions, pointing behind and in front of the display plane, respectively. b Depiction of the hypothetical arrangement of the chain-like structure upon contact of an NK cell (bottom, blue) with a target cell (top, green) showing the crystal structure of two NKR-P1 dimers (cyan and blue) interacting with two LLT1 dimers (green and lemon) in the primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) modes. The first three N-terminal residues in the structures are highlighted in red. The flexible stalk regions connecting the N-termini and cell membranes are represented as speckled lines of the corresponding color-coding. The view on the right-hand side is clipped for clarity at the plane indicated on the left-hand side view. c Schematic depiction of NKR-P1 extracellular domain dynamics and possible ligand binding arrangements. NKR-P1 is expressed as a disulfide-linked homodimer; however, its CTLDs may undergo conformation change similar to monomer-dimer equilibrium. Such putative equilibrium would be shifted towards monomeric species for the wild-type protein and its I168T allelic variantC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3460"> 51. Dans le même temps, un arrangement dimère correspondant au dimère non covalent observé dans les structures cristallines décrites ici serait favorisé pour la variante S159A (côté gauche). Un tel dimère NKR-P1 pourrait alors interagir avec le ligand LLT1 apparenté (lui-même étant également exprimé sous la forme d'un homodimère lié au disulfure et formant des dimères non covalents stables avec ses CTLD) dans le modèle standard précédemment suggéré d'interaction récepteur des cellules NK - ligand CTL (au milieu) ou en alternance avec le ligand dimère dans l'arrangement en chaîne proposé basé sur la structure cristalline complexe NKR-P1: LLT1 (côté droit).

Pour déterminer si de tels oligomères de type fermeture éclair de NKR-P1: LLT1 se produisent non seulement dans le cristal et dans une certaine mesure en solution (Fig. 5 et Fig. 5 supplémentaire), mais également à la surface de la cellule, nous avons utilisé la microscopie de localisation à molécule unique pour examiner les transfectants NKR-P1 pleine longueur marqués avec l'AcM anti-NKR-P1 AlexaFluor® 647 en présence ou en l'absence de LLT1 et LLT1SIM solubles (Fig. 6). Nous avons observé une augmentation significative de la taille et de la surface du groupe NKR-P1 d'événements fluorescents lors de l'ajout de LLT1, mais pas de son mutant de mode d'interaction secondaire, LLT1SIM. Bien que la configuration expérimentale avec un partenaire de liaison intégré dans la membrane et l'autre étant présenté comme soluble ne décrit pas complètement la réalité biologique du contact intercellulaire, nous supposons que limiter l'interaction à un espace bidimensionnel entre les membranes de deux cellules adjacentes dans le cas de protéines disulfuriques pleine longueur ne ferait que le renforcer. Notre expérience visait à tester l'hypothèse de la capacité du récepteur NKR-P1 à former des clusters (oligomères réticulés) dans le contexte de la membrane cellulaire lors de l'engagement des espèces dimères de LLT1. Cette configuration expérimentale nous a permis de normaliser la concentration de LLT1 tout au long de la mesure tout en garantissant la présence de LLT1 principalement dimérique dans la solution. De plus, nos données SEC-SAXS étaient mieux adaptées aux chaînes multimères en modes d'interaction primaire et secondaire alternés (Fig. 5 supplémentaire), même si toute la bibliothèque de tous les modèles possibles, y compris ceux basés uniquement sur le mode primaire ou secondaire, a été inclus. dans l'analyse. Des valeurs de χ2 acceptables ont été obtenues principalement pour les modèles multimères contenant l'arrangement alterné. Pris ensemble, nous concluons que la combinaison des deux modes d'interaction est nécessaire pour une interaction multimérique biologiquement plausible, comme en témoignent les résultats du test de cytotoxicité à médiation cellulaire NK (Fig. 7).

Bien qu'une telle multimérisation fonctionnelle des CTLR NK ait été pour la plupart négligée, la formation de nanoclusters similaires est bien décrite pour l'interaction entre la famille des immunoglobulines des KIR et les glycoprotéines de classe I du CMH53 ou l'interaction entre KIR2DL1 et NKG2D54. De plus, un réseau périodique en forme de fermeture éclair de dimères en interaction a été signalé dans les structures cristallines des immunocomplexes co-stimulateurs B7-1:CTLA-4 et B7-2:CTLA-455,56. Fait intéressant, B7-1 est exprimé à la surface des cellules dans un équilibre dynamique entre les monomères et les dimères non covalents. Lors de l'interaction avec le récepteur co-stimulateur CD28, B7-1 forme un réseau d'interaction composé d'homodimères B7-1 et CD28. Le découplage de cette interaction est facilité par la dissociation de B7-1 aux monomères, tandis que l'insertion du dimère obligatoire B7-1 conduit à une signalisation prolongée et anormale entre les cellules présentatrices d'antigène et les cellules T57.

Bien qu'en tant que protéines de pleine longueur, LLT1 et NKR-P1 forment des homodimères disulfures covalents à la surface cellulaire7,36, à notre connaissance, l'état dimère de leurs ectodomaines CTL n'a pas encore été évalué dans des cellules vivantes. Inversement, la formation de l'homodimère non covalent centré sur l'hélice α2 de l'ectodomaine LLT1 soluble a déjà été caractérisée40,43,44 et se produit probablement également dans la protéine pleine longueur. Le dimère humain centré en hélice NKR-P1 α1 utilise moins de contacts intermoléculaires, a une surface de contact plus petite que les CTLR dimères centrés en hélice α2 et est donc moins stable. Néanmoins, sa formation devrait augmenter dans le contexte de l'homodimère disulfure du récepteur NKR-P1 de pleine longueur. Dans le même temps, la longueur de la région de la tige NKR-P1 (25 acides aminés) confère une flexibilité suffisante pour l'équilibre monomère / dimère CTLD au sein de l'homodimère disulfure du récepteur de pleine longueur lui-même, qui serait ensuite régulé davantage par polymorphisme et glycosylation hétérogénéité à l'interface de dimérisation NKR-P1 (Fig. 8c, en bas à gauche). Ainsi, de manière similaire au système B7-1: CD28, un équilibre entre les états monomères et dimères des ectodomaines CTL, modifiant et affinant la capacité de NKR-P1 à former des complexes stables d'ordre supérieur avec LLT1, peut par conséquent réguler la force et la signalisation du système NKR-P1:LLT1, tandis que la réticulation de NKR-P1 par LLT1 dans la synapse immunitaire peut fournir une avidité suffisante pour une transduction de signal stable par ce complexe d'interaction de faible affinité.

En conclusion, les données présentées montrent que la structure cristalline du complexe NKR-P1: LLT1 constitue une nouvelle voie de multimérisation du récepteur des cellules NK de type lectine de type C: ligand à la surface de la cellule qui explique comment la liaison du ligand surmonte la faible affinité par le récepteur. réticulation au sein de la synapse immunitaire.

La forme H176C stabilisée de l'ectodomaine LLT1 soluble (Gln72-Val191) a été exprimée de manière transitoire dans les cellules HEK293S GnTI-, comme décrit précédemment44. Le mutant de mode d'interaction secondaire N120R, R153E, K169A LLT1SIM a été cloné et produit de la même manière. Le domaine de type lectine de type C de NKR-P1 humain a été produit de manière similaire dans des cellules HEK293S GnTI– transfectées de manière stable50. En bref, la construction d'expression correspondant au domaine CTL extracellulaire de NKR-P1 (Gly90-Ser225) a été sous-clonée dans le plasmide pOPINGGTneo (aimablement fourni par le professeur Ray Owens, Université d'Oxford), flanqué du leader de sécrétion N-terminal et de le His-tag C-terminal (avec l'ETG et le KHHHHHH aux extrémités N- et C-terminales de la protéine sécrétée, respectivement). La culture en suspension de cellules HEK293S GnTI–58 a été transfectée avec un mélange 1: 3 (p/p) du plasmide d'expression et de la polyéthylèneimine linéaire de 25 kDa. Le pool de cellules transfectées de manière stable a été sélectionné sur 200 ng/ul de G418 en trois semaines. Les protéines sécrétées ont été purifiées à partir du milieu récolté par chromatographie en deux étapes - une IMAC a été réalisée sur une colonne Talon (GE Healthcare), suivie d'une SEC sur un Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) dans 10 mM HEPES pH 7,5 avec NaCl 150 mM et NaN3 10 mM. Pour la microscopie dSTORM et les tests de cellules NK in vitro (voir ci-dessous), le tampon a été remplacé par un PBS de qualité culture tissulaire (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4). Pour la déglycosylation, Endo F159 fusionné à la GST a été ajouté dans un rapport pondéral de 1: 100 aux protéines dans un tampon SEC avec du citrate 50 mM pH 5, 5 et incubé pendant 2 h à 37 ° C. Les protéines déglycosylées ont ensuite été purifiées par chromatographie d'affinité discontinue sur résine Glutathion Sepharose 4B (GE Healthcare) suivie d'une SEC, comme décrit ci-dessus.

NKR-P1 glycosylé (structure NKR-P1_glyco) - L'ectodomaine NKR-P1 humain soluble à 20 mg / ml dans un tampon SEC a été cristallisé à l'aide de la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise. Des gouttes (100 nl de solution réservoir et 100 nl de solution protéique) ont été mises en place à l'aide d'un robot Cartesian Honeybee 961 (Genomic Solutions) à 294 K. Le réservoir était constitué de 20 % (p/v) de PEG 3350, 200 mM de di-sodium tartrate pH 7,2 (écran PEG/Ion, condition 36 ; Hampton Research). Un cristal hexagonal de dimensions 150 × 150 × 20 µm a été cryoprotégé par trempage dans la solution réservoir additionnée de 25 % (v/v) d'éthylène glycol.

NKR-P1 déglycosylé (structure NKR-P1_deglyco) - L'ectodomaine NKR-P1 humain soluble déglycosylé par endo F1 a été concentré à 12 mg / ml et cristallisé comme décrit ci-dessus. Le réservoir était composé de 20 % (p/v) de PEG 3350, de fluorure d'ammonium 200 mM et de chlorure de lithium 200 mM pH 6,2 (écran PEG/Ion, condition 3, écran additif, condition 17 ; Hampton Research). Un cristal en forme de bâtonnet de 50 × 50 × 150 µm a été cryoprotégé comme ci-dessus en ajoutant 25 % (v/v) de glycérol.

Complexe NKR-P1: LLT1 (structure NKR-P1: LLT1) - Les ectodomaines NKR-P1 et LLT1 humains solubles déglycosylés par Endo F1 ont été mélangés à un rapport molaire de 1: 1 et concentrés à 8 mg / ml de concentration totale de protéines. Le complexe protéique a été cristallisé comme décrit ci-dessus ; gouttes (200 nl du réservoir et 100 nl de solutions protéiques) ont été ensemencées avec 50 nl de solution mère de cristaux aciculaires broyés de NKR-P1 déglycosylé cultivés dans 20 % (p/v) de PEG 3350, pH de fluorure d'ammonium 200 mM 6.2 (écran PEG/Ion, condition 3 ; Hampton Research). Le réservoir consistait en sulfate d'ammonium 200 mM, 20 % (p/v) PEG MME 5000, Tris 100 mM pH 7,5 (écran Proplex, condition 1-40 ; dimensions moléculaires). Un cristal bipyramide tétragonal de dimensions 30 × 30 × 80 µm a été cryoprotégé comme détaillé ci-dessus en ajoutant 25 % (v/v) de glycérol.

Toutes les données de diffraction ont été recueillies à la Diamond Light Source (Harwell, Royaume-Uni) à la ligne de lumière I03 en utilisant une longueur d'onde de 0,97625 Å et un détecteur PILATUS3 6 M. La distance cristal-détecteur a été fixée à 340 mm, le temps d'exposition par image était de 0,02 s, la largeur d'oscillation était de 0,1 ° et la température était de 100 K. 7200 images ont été collectées pour chaque ensemble de données. Dans le cas du complexe NKR-P1:LLT1, seules 5000 images ont finalement été utilisées pour le traitement des données. Toutes les images de diffraction ont été indexées et intégrées à l'aide du package XDS60, mises à l'échelle à l'aide d'AIMLESS61, et 5 % des réflexions sélectionnées au hasard ont été utilisées comme un ensemble Rfree. Le problème de phase a été résolu par remplacement moléculaire – NKR-P1_glyco : dans le programme BALBES62 en utilisant la structure du récepteur des cellules NK humaines KLRG1 lié à la E-cadhérine (https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/pdb)63 ; NKR-P1_deglyco : 6 chaînes trouvées dans PHASER64 à l'aide de NKR-P1A murin (https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb)65 ont été complétées par 2 chaînes trouvées dans MOLREP66 ; NKR-P1:LLT1 : 4 chaînes trouvées dans BALBES car les chaînes NKR-P1 (utilisant la structure de la dectine-1 murine, https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb)48 ont été complétées par deux autres chaînes dans MOLREP, et les 6 chaînes ont été réinterprétées manuellement comme 4 chaînes NKR-P1 et comme 2 chaînes LLT1. Le raffinement a été effectué à l'aide de REFMAC567 et de l'édition manuelle dans COOT68. Le dernier cycle de raffinement a été complété en utilisant toutes les réflexions. Les paramètres finaux de traitement et de structure des données sont décrits dans le tableau 1.

NKR-P1_glyco - La structure, comprenant un dimère du NKR-P1 CTLD humain glycosylé, est globalement bien définie dans la carte de densité électronique, correspondant à la haute résolution de la structure (1,8 Å). La glycosylation à l'interface de dimérisation ne montre pas les caractéristiques de chevauchement observées dans les structures de NKR-P1 déglycosylé (ci-dessous). GlcNAc a été modélisé sur Asn116 avec une occupation complète dans les deux chaînes, alors que la glycosylation à Asn157 n'a pas été observée dans la carte de densité électronique. Toutes les chaînes de glycosylation modélisées (GlcNAc2Man5 à A/Asn169, GlcNAc2Man3 à B/Asn169 et GlcNAc aux résidus Asn116 dans les deux chaînes) sont bien localisées dans la carte de densité électronique.

NKR-P1_deglyco - L'unité asymétrique comprend quatre dimères du NKR-P1 CTLD humain déglycosylé après la première unité GlcNAc. La longueur de la partie localisée de la chaîne protéique varie des chaînes les plus courtes A, F et G, avec les résidus modélisés Leu91–Leu214, à la plus longue chaîne H, avec les résidus Gly90–Arg218. GlcNAc au résidu Asn169 est bien localisé, tandis que les unités GlcNAc liées à Asn116 et Asn157 à l'interface de dimérisation sont présentes dans des positions alternatives et se chevauchant ; le résidu Asn116 montre également des conformères alternatifs. Les unités GlcNAc attachées à Asn157 et Asn116 ont été modélisées avec 0,5 occupations, et seules les unités les plus distinctes de chaque paire qui se chevauchent ont été modélisées (tableau 1).

NKR-P1: LLT1 - L'unité asymétrique contient deux dimères du NKR-P1 CTLD humain et un dimère du LLT1 CTLD. La structure a une carte de densité électronique bien définie et toutes les chaînes protéiques peuvent être attribuées sans ambiguïté. Les pics de différence les plus distincts correspondent à des petits ligands non interprétables. LLT1 a des unités GlcNAc bien localisées aux résidus Asn95 et Asn147. Les unités GlcNAc localisées de NKR-P1 sont les mêmes que celles identifiées dans la structure NKR-P1_deglyco (paragraphe précédent).

Les spectres de dichroïsme circulaire (CD) de type sauvage et S159A NKR-P1 et de type sauvage et SIM LLT1 ont été enregistrés à l'aide d'un spectropolarimètre Chirascan Plus CD avec le logiciel Pro-Data Chirascan (Applied Photophysics) et une cellule à quartz de 0, 1 cm de longueur de trajet. Les spectres ont été enregistrés sur la gamme de longueurs d'onde de 195 à 260 nm par pas de 1 nm à température ambiante. Les concentrations d'échantillon étaient de 0,2 mg/ml et 0,3 mg/ml pour les échantillons de protéines NKR-P1 et LLT1, respectivement, dans un tampon d'échantillon HEPES 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,5. Le signal CD a été exprimé en ellipticité et les spectres résultants ont été soustraits du tampon. La composition de la structure secondaire a été analysée à l'aide du logiciel CDNN 2.1 (Applied Photophysics).

La formation du complexe NKR-P1:LLT1 et la dimérisation du mutant NKR-P1 S159A ont été analysées dans une ultracentrifugeuse analytique ProteomeLab XL-I (Beckman Coulter)69. Pour l'expérience de vitesse de sédimentation, des échantillons de NKR-P1 glycosylé, de LLT1 et de leurs mélanges équimolaires avec des concentrations croissantes dans un tampon SEC ont été centrifugés dans le rotor An-50 Ti (Beckman Coulter) à 48 000 tr/min à 20 °C et 150 balayages avec Une résolution spatiale de 0,003 cm a été enregistrée par étapes de 5 minutes à l'aide d'une optique d'absorbance. La centrifugeuse a été opérée à l'aide du logiciel ProteomeLab (Beckman Coulter). La densité du tampon et les volumes spécifiques partiels de protéines ont été estimés dans SEDTERP (http://www.jphilo.mailway.com). Les données ont été analysées avec SEDFIT70 en utilisant le modèle de distribution continue c(s). Les isothermes de liaison (et les figures illustrant les données AUC) ont été préparées dans GUSSI71 puis ajustées au mieux dans SEDPHAT72 en utilisant des modèles d'hétéro-association A + B ⇔ AB ou A + B ⇔ AB + B ⇔ ABB, où A est le dimère LLT1 et B est Monomère NKR-P1, respectivement. Seuls les coefficients KD et de sédimentation de AB ou ABB ont été flottants dans l'ajustement ; les autres paramètres ont été maintenus constants à des valeurs connues.

Pour les mesures de thermophorèse à l'échelle microscopique (MST) des interactions NKR-P1:LLT1 et NKR-P1:LLT1SIM, le NKR-P1 a été marqué par fluorescence avec Atto 488 NHS-ester (Merck) à pH 6,5 ; le marqueur en excès a été éliminé par chromatographie d'exclusion stérique. NKR-P1 100 nM marqué par fluorescence a été mélangé avec une série de dilutions de LLT1 ou LLT1SIM et analysé dans des capillaires standard dans un monolithe NT.115 à l'aide du logiciel MO.Control (NanoTemper), 30 % de puissance d'excitation LED et 60 % de puissance MST. Les données brutes ont été analysées dans PALMIST73 ; les isothermes exportées étaient mieux ajustées dans SEDPHAT72 et les chiffres préparés dans GUSSI71.

Les données SEC-SAXS pour le complexe NKR-P1:LLT1 ont été collectées à la Diamond Light Source (Didcot, Royaume-Uni) à la ligne de lumière 21 à l'aide d'un système HPLC Agilent 1200 avec une colonne Superdex 200 de 2,4 ml (GE Healthcare), un détecteur Pilatus P3-2M , rayonnement de 12,4 keV et distance échantillon-détecteur de 4,014 m. Les ectodomaines NKR-P1 et LLT1 humains avec des glycanes GlcNAc2Man5 dilués dans HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, NaN3 10 mM, pH 7, 5 ont été mélangés à un rapport molaire de 1: 1. Les données ont été recueillies à 293 K pour les échantillons de tampon et de protéines à une concentration de charge de 15 mg/ml. Les données dans des intervalles sélectionnés (images 355–367, 368–378, 379–388, 388–399, 431–440, 481–491) ont été soustraites au solvant dans SCÅTTER (développé par Robert Rambo au Diamond Light Source, https : //www.bioisis.net/tutorials/9) puis dans les intervalles séparément fusionnés et caractérisés à l'aide du package ATSAS74. Comme preuve de la qualité des données, le diagramme de diffusion, le diagramme de Kratky et la fonction de distribution de distance de paire P(r) sont illustrés à la Fig. 5 pour les intervalles 389–399 (un échantillon de données allant du premier pic) et 481–491 plage de données d'échantillon à partir du deuxième pic). Les diagrammes de diffusion et de Guinier pour toutes les plages de données sont présentés dans la Fig. 5 supplémentaire. L'accord entre les données SAXS et notre structure cristalline 3D du complexe NKR-P1: LLT1 a été évalué à l'aide d'OLIGOMER75. Une bibliothèque de modèles structurels NKR-P1 et LLT1 représentant des monomères, des dimères et leurs multimères en interaction dans diverses permutations de modes d'interaction primaires et secondaires a été générée dans PyMOL à partir des structures cristallines résolues ici en appliquant des opérations de symétrie (au total, 49 modèles différents). L'algorithme OLIGOMER a ensuite été laissé pour sélectionner leurs combinaisons pour s'adapter au mieux à toutes les courbes de diffusion individuelles et aux courbes résultant des six intervalles de données fusionnés sélectionnés (Données supplémentaires 1 et Fig. 5 supplémentaires).

Des transfectants stables NKR-P1 de pleine longueur ont été générés dans la lignée cellulaire HEK293S GnTI– en utilisant le système à base de transposon piggyBac avec expression de protéine inductible par la doxycycline76. Des échantillons microscopiques ont été préparés à partir de cellules traitées avec 5 ng/ml de doxycycline pendant une nuit. Les cellules ont été lavées avec du PBS et incubées pendant 1 h à 37 ° C avec 8, 4 mg / ml de LLT1 ou LLT1SIM dans du PBS ou du PBS seul. Après incubation, les cellules ont été laissées se déposer sur la surface de lames de verre recouvertes de PLL pendant 25 min à 37 ° C. Les cellules ont ensuite été fixées avec 4 % de PFA et 0,2 % de GA pendant 10 min à température ambiante et lavées trois fois avec du PBS. Pour la coloration des anticorps, les cellules ont d'abord été bloquées avec 5 % de BSA pendant 30 min et colorées avec l'anticorps Alexa Fluor® 647 anti-humain CD161 (clone HP-3G10 ; BioLegend) à 10 µg/ml dans une solution de blocage pendant 60 min. Les échantillons ont été lavés cinq fois avec du PBS avant la post-fixation avec 4 % de PFA et 0,2 % de GA pendant 10 min. Enfin, les cellules ont été traitées avec du NH4CI 15 mM et lavées deux fois avec du PBS. Les images dSTORM ont été acquises avec Elyra PS.1 à l'aide du logiciel Zen Black edition (Carl Zeiss). Les marqueurs de repère (FluoSpheres F8801; Thermo Fisher) ont été dilués dans du PBS et laissés se déposer sur l'échantillon pendant 1 h (la dilution finale du stock de billes était de 100 000 ×). Avant chaque mesure, le tampon a été remplacé par un tampon d'imagerie à base de glucose oxydase/catalase/MEA, et l'échantillon a été scellé avec du verre de couverture et du silicium pour empêcher l'oxydation du tampon. Pour chaque cellule, 2 × 104 images brutes ont été acquises en mode d'éclairage HP TIRF avec un temps d'exposition de 15 ms, en utilisant 100% de la puissance laser de 642 nm et un objectif à immersion dans l'huile 100 ×, 1, 46 ouverture numérique. Nous avons utilisé le même lot et la même concentration de l'anticorps pour assurer un étiquetage cohérent dans les mesures uniques pour toutes les expériences. De plus, nous avons toujours mesuré les conditions avec et sans le ligand soluble dans chaque série de mesures individuelles pour assurer une qualité globale des données cohérente dans toute l'étude.

Les images dSTORM en super-résolution ont été reconstruites à partir de séquences d'images brutes avec le plug-in ThunderSTORM77 pour le logiciel de traitement ImageJ78. La localisation sous-pixel des molécules a été réalisée en ajustant un modèle de fonction d'étalement de point gaussien intégré à l'aide de la méthode d'ajustement d'estimation de vraisemblance maximale79. Les images dSTORM reconstruites ont été corrigées pour la dérive à l'aide de marqueurs fiduciaires et pour les localisations multiples à partir d'une source unique en fusionnant des événements dans les 20 nm apparaissant dans les images suivantes (avec un décalage de 5 images). L'analyse des grappes de tessellation de Voronoi a été réalisée dans ClusterViSu80 sur toute la surface interne de la cellule (les bords des cellules et les autres régions membranaires concentrées ont été exclus de l'analyse). Une valeur seuil de 250 a été choisie en comparant la distribution des valeurs de surface du polygone de Voronoi entre les localisations dans les zones expérimentales et les régions randomisées de la même densité d'événements. Les clusters contenant moins de deux événements fluorescents ont été éliminés de l'ensemble de données. Plusieurs moyennes ont été comparées à une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec correction de Bonferroni dans OriginPro 2018. Les graphiques montrent les valeurs moyennes et les barres d'erreur représentent l'écart-type. Les valeurs de p > 0,05 sont indiquées comme non significatives ; les valeurs p statistiquement significatives sont indiquées par des astérisques (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

L'influence de LLT1 ou LLT1SIM sur l'inhibition de l'activité cytotoxique des cellules NK primaires a été évaluée par cytométrie en flux. Des couches leucocytaires pour l'isolement des cellules NK humaines ont été achetées à l'Institut d'hématologie et de transfusion sanguine (IHBT, Prague, République tchèque) comme matériel à des fins de recherche. L'IHBT a obtenu le consentement des donneurs. Les cellules NK primaires ont été isolées par sélection négative à l'aide d'un kit d'isolement de cellules NK (Miltenyi Biotec) selon le protocole du fabricant. Les cellules NK purifiées ont été cultivées pendant une nuit à 1 × 106 cellules/ml dans du RPMI 1640 additionné de 10 % de FCS, 100 unités/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine et 80 ng/ml d'IL-2 (Sigma–Aldrich) pour leur activation . Les cellules cibles K562 ont été colorées avec le kit de prolifération CellTrace Violet (Thermo Fisher). Après la coloration, 1 × 104 cellules cibles ont été mélangées avec des cellules NK activées dans un rapport de 40: 1 (E: T), et les protéines LLT1 ou LLT1SIM ont été ajoutées, en maintenant le volume de réaction final à 20 μl (6,5 μl de K562 et 6,5 µl de suspensions de cellules NK et 7 µl des solutions mères de protéines concentrées dans du PBS, jusqu'à une concentration finale en protéines de 50 ou 250 µM). Après 4 h d'incubation, le mélange cellulaire a été centrifugé à 300 × g et coloré avec 1 μg/ml de 7-AAD. Les cellules ont été analysées à l'aide d'un cytomètre en flux BD LSR II et du logiciel BD FACSDiva (BD Biosciences) dans trois tests de cytotoxicité indépendants réalisés à l'aide de cellules NK provenant de trois donneurs sains différents en triple exemplaire. Les données ont été analysées dans le logiciel FlowJo (BD Biosciences). La stratégie de déclenchement pour l'analyse par cytométrie en flux est illustrée à la Fig. 7 supplémentaire. Les données sont présentées sous forme de moyenne de mesures avec SD. Le cas échéant, les données ont été évaluées statistiquement par ANOVA unidirectionnelle avec des valeurs de p <0, 05 considérées comme statistiquement significatives.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les fichiers raffinés de coordonnées et de facteurs de structure pour les structures cristallines aux rayons X rapportés dans cette étude ont été validés par la Protein Data Bank (https://www.wwpdb.org) et déposés là-bas sous les numéros d'accès de https://doi .org/10.2210/pdb5MGR/pdb (NKR-P1_glyco), https://doi.org/10.2210/pdb5MGS/pdb (NKR-P1_deglyco) et https://doi.org/10.2210/pdb5MGT/pdb (NKR- P1:LLT1). Les liens vers les autres entrées de l'APB dans cet article sont https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/ pdb, https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb, https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb, https://doi. org/10.2210/pdb5J2S/pdb et https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb. Les données de diffraction ont été déposées dans la banque de données SBGrid sous les codes 778 (NKR-P1_glyco ; https://doi.org/10.15785/SBGRID/778) ; 779 (NKR-P1_deglyco, https://doi.org/10.15785/SBGRID/779) et 780 (NKR-P1:LLT1 ; https://doi.org/10.15785/SBGRID/780). Les données de diffraction de l'expérience SEC-SAXS ont été déposées auprès de Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j31)81. Le résultat total de l'analyse OLIGOMER des données SEC-SAXS est disponible en tant que données supplémentaires 1. Les données sources sont fournies avec cet article.

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Cette étude a été soutenue par les subventions de la Fondation tchèque pour la science 15-15181 S et 18-10687 S à OV, le ministère de l'Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque accorde LTC17065 à OV (dans le cadre de l'action COST CA15126 MOBIEU), les projets 161216 et 1378219 de la Charles University Grant Agency à JB et BK, et le Fonds européen de développement régional (CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000447). La microscopie a été réalisée dans le Laboratoire de microscopie confocale et de fluorescence, cofinancé par le Fonds européen de développement régional et le budget de l'État de la République tchèque (projets n° CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00 /21515) et soutenu par le grand projet RI Czech-BioImaging LM2018129. Les ressources informatiques ont été fournies par le projet "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140) fourni dans le cadre du programme Projets de grandes infrastructures de recherche, de développement et d'innovations. Nous reconnaissons l'utilisation des méthodes CF Biophysical de CMS, CIISB, Instruct-CZ Centre, soutenu par MEYS CR (LM2018127). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Carlos V. Melo pour la relecture critique du manuscrit. Les auteurs reconnaissent également le soutien et l'utilisation des ressources d'Instruct-ERIC à travers le programme pilote de R&D APPID 56 et 286 à OV et JB, et du projet BioStruct-X EC FP7 283570. Le Wellcome Center for Human Genetics est soutenu par le Wellcome Trust (subvention 090532/Z/09/Z). Nous remercions Diamond Light Source pour le temps de faisceau (proposition MX10627) et le personnel des lignes de lumière I03 et 21 pour leur aide à la collecte de données.

Jean Blaha

Adresse actuelle : EMBL, Hamburg Unit c/o DESY, Notkestrasse 85, 22607, Hambourg, Allemagne

Barbora Kalousková

Adresse actuelle : Institut de physique appliquée - Groupe de biophysique, TU Wien, Getreidemarkt 9, 1060, Vienne, Autriche

Denis Cmunt

Adresse actuelle : Département d'oncologie, Institut Ludwig de recherche sur le cancer, Université de Lausanne, Chemin des Boveresses 155, 1066, Epalinges, Suisse

Samuel Pazicky

Adresse actuelle : School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Nanyang Drive 60, 637551, Singapour, Singapour

Département de biochimie, Faculté des sciences, Université Charles, Hlavova 2030, 12800, Prague, République tchèque

Jan Bláha, Barbora Kalousková, Ondřej Skořepa, Denis Cmunt, Samuel Pazicky, Edita Poláchová, Celeste Abreu & Ondřej Vaněk

Institut de biotechnologie, Académie tchèque des sciences, Centre BIOCEV, Průmyslova 595, 25250, Vestec, République tchèque

Tereza Skálová, Jan Stránský, Tomáš Kovaľ, Jarmila Dušková, Jindřich Hašek & Jan Dohnálek

Département de biologie cellulaire, Faculté des sciences, Université Charles, Viničná 7, 12800, Prague, République tchèque

Valéria Grobarova

Division de biologie structurale, Wellcome Centre for Human Genetics, Université d'Oxford, Roosevelt Drive, OX3 7BN, Oxford, Royaume-Uni

Yuguang Zhao et Karl Harlos

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JB, OS, BK, SP, EP et CA ont contribué à l'expression et à la purification des protéines ; JB et YZ ont effectué la cristallisation des protéines ; YZ et KH ont effectué les mesures de diffraction des rayons X ; JB, TS, JS, TK, J.Du. et J.Do. contribué au traitement des données et au raffinement du modèle ; OS a effectué la mesure des données SEC-SAXS ; JB et TS ont effectué l'analyse des données SAXS ; OV a effectué les mesures et analyses d'ultracentrifugation analytique ; JB et BK ont acquis et analysé les données dSTORM ; BK, VG et DC ont effectué le test de cytotoxicité NK ; JB, TS, J.Do. et OV ont conçu les expériences et rédigé le manuscrit avec la contribution critique de JH

Correspondance à Ondřej Vaněk.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Bláha, J., Skálova, T., Kalousková, B. et al. La structure du complexe récepteur:ligand des cellules NK humaines NKR-P1: LLT1 révèle un regroupement dans la synapse immunitaire. Nat Commun 13, 5022 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

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Reçu : 06 novembre 2021

Accepté : 05 août 2022

Publié: 26 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

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