Dérivation robuste de neurones dopaminergiques transplantables à partir de cellules souches pluripotentes humaines par administration chronométrée d'acide rétinoïque

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3046 (2022) Citer cet article

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Les thérapies à base de cellules souches pour la maladie de Parkinson (MP) sont entrées dans les premiers essais cliniques chez l'homme en utilisant un ensemble de méthodes techniquement apparentées pour produire des neurones dopaminergiques mésencéphaliques (mDA) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC). Ici, nous décrivons une approche pour la dérivation à haut rendement des neurones mDA qui diffère principalement des technologies alternatives en utilisant la signalisation de l'acide rétinoïque (RA), au lieu de la signalisation WNT et FGF8, pour spécifier le destin mésencéphalique. Contrairement à la plupart des signaux morphogènes, où la concentration précise détermine le destin cellulaire, c'est la durée d'exposition à la PR qui est le paramètre clé de la spécification mésencéphalique. Cette approche de structuration insensible à la concentration offre une robustesse et réduit le besoin d'ajustements de protocole entre les lignes hPSC. Les progéniteurs spécifiés par RA se différencient rapidement en neurones mDA fonctionnels in vitro, et réussissent à greffer et à soulager les déficits moteurs après la transplantation dans un modèle de PD de rat. Notre étude fournit une voie alternative potentielle pour la thérapie cellulaire et la modélisation des maladies qui, en raison de sa robustesse, pourrait être particulièrement utile lorsque l'utilisation de cellules autologues ou immunologiquement appariées est envisagée.

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sous forme de cellules souches embryonnaires (hESC) ou de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) fournissent une source cellulaire évolutive pour la production de sous-types spécifiques de neurones pouvant être utilisés pour la découverte de médicaments à haut débit, la maladie modélisation ou thérapie de remplacement cellulaire dans les maladies neurodégénératives1,2. Les neurones dopaminergiques mésencéphaliques (mDA) dans le mésencéphale ventral (vMB) présentent un intérêt particulier en raison de leur dégénérescence relativement sélective dans la maladie de Parkinson (MP), et comme des expériences cliniques pionnières utilisant du tissu de mésencéphale fœtal humain ont fourni une preuve de concept que la dopamine greffée les neurones peuvent restaurer la neurotransmission de la dopamine et procurer un soulagement à long terme chez certains patients parkinsoniens3.

Les méthodes de dérivation in vitro de neurones mDA humains à usage clinique ont été progressivement améliorées et, après une évaluation approfondie de l'innocuité et de l'efficacité fonctionnelle dans des modèles animaux précliniques, la thérapie à base de cellules souches pour la MP est entrée dans la phase passionnante des essais cliniques utilisant des CSEh allogéniques ou hiPSCs comme matériau de départ2,4,5,6. L'utilisation de cellules allogéniques permet la production de grands lots de préparations congelées "prêtes à l'emploi" qui peuvent être utilisées pour traiter de nombreux patients avec le même produit cellulaire après validation de la sécurité et de l'efficacité dans des modèles animaux, mais un inconvénient est un besoin pendant un an d'immunosuppression pour éviter le rejet après la transplantation2. Les hiPSC spécifiques au patient sont optimaux d'un point de vue immunologique, mais ajoutent le défi important d'établir des hiPSC de qualité clinique pour chaque patient et de diriger efficacement ces cellules pour qu'elles adoptent un destin de neurone mDA avant la greffe. Les cellules spécifiques au patient ne sont donc pas susceptibles de devenir une thérapie de routine à ce stade de développement, bien qu'un rapport de cas récent ait fourni la preuve de concept qu'une approche autologue pour la thérapie cellulaire est réalisable7. L'utilisation de lignées hiPSC compatibles avec l'antigène leucocytaire humain (HLA) est une stratégie alternative pour réduire l'immunosuppression, mais nécessite un grand nombre de lignées hiPSC sélectionnées de type HLA pour couvrir la majorité de la population d'un pays8. Une autre approche intéressante consiste à établir des lignées hPSC universelles "uniques pour tous" qui pourraient fournir une tolérance immunitaire sans avoir besoin d'immunosuppression9, mais on ne sait pas quand et si ces lignées seront disponibles et approuvées pour une utilisation clinique. Par conséquent, si la thérapie cellulaire réparatrice s'avère sûre et efficace dans les essais cliniques, un développement probable est que les lignées hiPSC autologues et compatibles HLA seront explorées pour une utilisation clinique de routine. Outre un établissement normalisé de lignées hiPSC conformes aux bonnes pratiques de fabrication (BPF), cela exigera des protocoles de neurones mDA robustes qui montrent une faible variabilité des lignées cellulaires et des lots en réponse aux agents de structuration afin de minimiser les ajustements laborieux pour les lignées cellulaires individuelles.

Les protocoles actuels de neurones mDA basés sur les hPSC utilisent des ensembles similaires de signaux de structuration du développement pour diriger la différenciation des hPSC vers un destin de neurones mDA. La double inhibition du SMAD (dSMADi) est appliquée pour favoriser la sélection du destin neuronal en empêchant les hPSC d'adopter d'autres options de destin somatique ou extraembryonnaire via l'inhibition de la signalisation TGF-bêta et BMP aux premiers stades de différenciation10. Les progéniteurs neuronaux dérivés de hPSC adoptent un destin de prosencéphale (FB) en l'absence de signaux de structuration du développement. L'activation de la signalisation canonique WNT par l'inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3β (GSK3β) CHIR90021 (CHIR), souvent appliqué avec le FGF8, est utilisée pour imposer une identité régionale du mésencéphale (MB), en imitant la signalisation WNT1 et FGF8 émanant de l'organisateur isthmique à la limite MB-cerveau postérieur (HB)11. L'activation de la voie SHH est à son tour utilisée pour ventraliser les cellules et induire les progéniteurs de la plaque de sol du mésencéphale ventral (vMB) LMX1A + / FOXA2 + / OTX2 +, qui peuvent se différencier en neurones mDA fonctionnels après une culture à long terme in vitro ou après greffage dans des modèles animaux PD12, 13. Bien que la tâche de restaurer la neurotransmission de la dopamine et d'inverser les déficits moteurs dans les modèles précliniques puisse clairement être réalisée à l'aide de ces méthodes, la réponse de structuration antéro-postérieure (AP) des hPSC différenciées au CHIR est très sensible à la concentration et nécessite des ajustements minutieux du protocole entre les lignées cellulaires12, 14,15,16. L'évaluation d'un large ensemble d'expériences de greffage a en outre lié la variabilité inter-expérimentale à la spécification imprécise de vMB et à la contamination des progéniteurs diencéphaliques malgré un titrage CHIR optimisé, qui pourrait être ajusté par l'activité caudalisante complémentaire du FGF817 ou avec traitement CHIR biphasique (CHIR-boost)18 qui a réduit la contamination diencéphalique et induit une identité EN1+ vMB plus caudale des cellules. Néanmoins, une étude récente établit que l'ablation de 4 gènes de structuration caudalisants dans les CSEh favorisant les destins de l'HB et de la moelle épinière entraîne une spécification plus cohérente et insensible à la concentration des progéniteurs vMB par CHIR, fournissant un support génétique que la structuration basée sur CHIR est intrinsèquement sensible à la concentration (préimpression dans bioRxiv)19. Le développement de méthodes qui ne reposent pas sur le CHIR pour spécifier l'identité mésencéphalique pourrait donc potentiellement aboutir à des paradigmes de différenciation plus robustes avec une variabilité de lot à lot et de lignée cellulaire à lignée cellulaire plus faible. En outre, les concentrations élevées de CHIR utilisées pour imposer l'identité du mésencéphale devraient inhiber un large éventail de kinases en plus de GSK3β20, ce qui incite davantage à envisager des stratégies de différenciation qui ne reposent pas sur CHIR21.

L'organisateur isthmique est un centre de signalisation secondaire établi après que la régionalisation de la plaque neurale rostrale en territoires cérébraux a été initiée22. La structuration précoce du cerveau implique par conséquent des signaux opérant en amont de WNT1 et FGF8, et certaines observations impliquent que l'acide rétinoïque (AR) dérivé de la vitamine A peut contribuer à ce processus. La forte activité caudale de la PR est bien établie11. Il est donc communément admis qu'une exposition précoce à la PR est incompatible avec la dérivation de neurones d'origine plus rostrale dans le système nerveux central, et la PR ou la vitamine A sont souvent activement évitées dans les protocoles de neurones mDA basés sur les hPSC15,23,24. Cependant, des études ont rapporté une extension caudale des marqueurs FB et MB dans des embryons de cailles déficients en vitamine A25 et il y a une expansion rostrale du HB chez des souris dépourvues des enzymes dégradant l'AR CYP26A1 et CYP26C126. De plus, des études chez la souris ont défini une fenêtre de temps transitoire précoce lorsque le tissu FB peut être re-spécifié dans une identité de type MB par RA27. Cela implique un potentiel d'application de la RA pour imposer le caractère du mésencéphale aux NSC dérivés de hPSC. La PR est également connue pour induire la dissolution de la pluripotence28 et pour favoriser la maturation des NSC naïfs aux stades initiaux du développement neuronal29, et pourrait donc éventuellement favoriser une conversion rapide des hPSC en NSC. Dans cette étude, nous montrons qu'une impulsion RA de 48 heures en combinaison avec l'activation de la voie SHH favorise une spécification rapide des progéniteurs vMB LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ qui se différencient en neurones mDA fonctionnels à haut rendement in vitro, et qui greffent et restaurent les déficits moteurs après transplantation dans un modèle rat de MP. Enfin, en ajustant simplement la durée de l'exposition à la PR, nous pourrions générer efficacement des neurones sérotoninergiques, montrant que la structuration basée sur la PR repose principalement sur la durée de l'exposition au signal et fournit une preuve de concept que cette propriété a une large applicabilité et peut être utilisée pour produire sous-types neuronaux cliniquement pertinents distincts des hPSC.

Pour explorer les activités de RA sur les hESC dirigés pour adopter un destin neuronal en réponse à dSMADi10, nous avons traité des cultures de la lignée hESC conforme aux BPF HS980 cultivées dans des conditions dSMADi avec 200 nM de RA tout-trans pour les 1, 2, 3 premières , ou 4 jours de différenciation (RA1D, RA2D, RA3D, RA4D) (Fig. 1a) et suivi du devenir et de l'identité des cellules à différents stades par immunotransfert, immunocytochimie quantitative, qPCR ou séquençage d'ARN (ARN-seq). Conformément aux études précédentes10, les cellules cultivées dans des conditions dSMADi uniquement ont subi une transition progressive d'un état de pluripotence (OCT4 +) à un état NSC naïf (SOX1 + PAX6 +) entre 0 et 7 jours en condition de différenciation (DDC) (Fig. 1b – d) . OCT4 a été progressivement régulé à la baisse et s'est approché de niveaux indétectables à ~ 5 DDC, comme l'a révélé l'immunocytochimie quantitative (Fig.1c). La régulation à la hausse de SOX1 et PAX6 à de faibles niveaux s'est produite à ~ 3 DDC (Fig. 1b). OCT4 et SOX1 ont été co-exprimés par des cellules entre 3 et 4 DDC (Fig. 1b, c et Supplémentaire Fig.1a) montrant que la conversion des hPSC en NSC en réponse à dSMADi englobe une fenêtre temporelle notable sur laquelle l'expression de la pluripotence- et les gènes spécifiques aux neurones se chevauchent. En revanche, dans les cultures traitées avec dSMADi et 200 nM RA pendant deux jours ou plus (dSMADi + RA2D, 3D), l'induction de SOX1 et PAX6 a été observée à 2 DDC (Fig. 1e et Fig. 1a supplémentaire) et l'expression d'OCT4 avait essentiellement été éteint par 3 DDC (Fig. 1b, c, f). Les niveaux d'expression de SOX1 et PAX6 à 3–4 DDC étaient nettement plus élevés dans les cultures dSMADi + RA2D par rapport aux cultures dSMADi uniquement (Fig. 1b, c, f et Fig. 1a supplémentaire). Au 7e jour du jour, l'expression de SOX1 et du marqueur de cellules souches neurales NESTIN était similaire dans les cultures dSMADi uniquement et dans les cultures dSMADi + RA2D (Fig.1d). L'analyse ARN-seq des cultures dSMADi + RA2D a suggéré une régulation négative globale des gènes de pluripotence et une régulation positive des gènes spécifiques à la lignée neurale à 2 DDC (Fig. 1e et Tableau supplémentaire 1). Les marqueurs de lignée endodermique ou mésodermique n'étaient pas régulés positivement (Fig. 1b supplémentaire). Une suppression rapide d'OCT4 et une régulation positive rapide de SOX1 ont été atteintes dans une plage de concentration de RA comprise entre 50 et 500 nM lorsque les cellules ont été cultivées dans des conditions dSMADi + RA2D (Fig. 1g). Le traitement des cellules avec 200 nM de PR pendant un jour (dSMADi + RA1D) n'était pas suffisant pour favoriser la suppression rapide de l'OCT4 ou la régulation rapide à la hausse de SOX1 (Fig. 1f), ni le traitement des cellules uniquement avec la PR (sans dSMADi) (Fig. 1c). En conséquence, la combinaison de dSMADi avec un traitement RA pendant 48 h ou plus favorise une transition rapide et semblable à un interrupteur d'un état de pluripotence à un état NSC.

a Schéma de différenciation hPSC avec chronologie de traitement avec dSMADi et RA. b Immunocytochimie pour le marqueur de pluripotence OCT4 et les marqueurs neuroectodermiques SOX1 et PAX6 sur des ESC et des cultures de 3 jours différenciées en double inhibiteurs de SMAD (dSMADi) ou en dSMADi avec une impulsion RA de deux jours (dSMADi + RA2D). c Tracé de densité de l'expression unicellulaire de SOX1 et OCT4 dans des cultures différenciées en dSMADi ou dSMADi + RA2D aux jours indiqués dans des conditions de différenciation (DDC). 670-760 cellules par condition et point de temps ont été quantifiées dans une différenciation représentative. d Immunocytochimie pour les marqueurs progéniteurs neuronaux NES et SOX1, et images en fond clair (BF) de cultures à 7 DDC différenciées dans les conditions indiquées. e Valeurs de changement log10 basées sur RNAseq de l'expression des gènes associés à la pluripotence ou au destin neuroectodermique dans les cultures dSMADi + RA2D à 2 DDC par rapport aux ESC. Valeur P et FDR dans le tableau supplémentaire 1, n = 2 expériences indépendantes. f Western blot représentatif pour OCT4 et SOX1 des cultures ESC et 3 DDC différenciées dans les conditions indiquées. g Western blot représentatif pour OCT4 et SOX1 de cultures ESC et 3 DDC cultivées dans des conditions dSMADi et traitées avec les concentrations indiquées de RA pendant deux jours. h Immunocytochimie pour les marqueurs identifiant les régions du cerveau antérieur (FOXG1), du cerveau antérieur et du cerveau moyen (OTX2), du cerveau postérieur (HOXA2) et du cerveau postérieur caudal (HOXB4) dans neuf cultures DDC différenciées dans dSMADi et traitées avec RA comme indiqué. i Résumé des effets de la durée de l'impulsion RA sur l'identité régionale de NSC. Barres d'échelle, 100 µm. Arb.units unités arbitraires, cerveau antérieur FB, cerveau moyen MB, cerveau postérieur HB.

Pour déterminer l'identité régionale des NSC dérivés de hPSC exposés à la PR pendant différentes périodes, nous avons analysé l'expression de facteurs de transcription dont l'expression seule ou en combinaison distingue les identités régionales FB, MB ou HB dans des cultures à 9 DDC. Le traitement dSMADi a été inclus dans toutes les expériences suivantes et ne sera pas davantage mis en évidence lors de la description des configurations expérimentales. Comme prévu, dans les cultures de hPSC non traitées avec RA (RA0D), les NSC ont acquis une identité de type FOXG1 + / OTX2 + / HOXA2− FB (Fig. 1h). Un caractère similaire à FB a été observé dans les cultures RA1D, bien que le niveau d'expression de FOXG1 + ait été quelque peu réduit (Fig. 1h et Fig. 1d supplémentaire). Fait intéressant, dans les cultures RA2D, les marqueurs FB ont été supprimés et les NSC ont plutôt exprimé un caractère de type FOXG1-/OTX2+/HOXA2-MB (Fig. 1h et Fig. 1d supplémentaire). Dans les cultures RA3D et RA4D, les NSC ont acquis une identité FOXG1-/OTX2-/HOXA2+/HOXB4- HB rostrale et FOXG1-/OTX2-/HOXA2+/HOXB4+ HB caudale, respectivement (Fig. 1h). Ces données montrent qu'une impulsion RA de 48 heures supprime le destin de FB et impose une identité de type MB aux NSC dérivés de hPSC, tandis qu'une exposition plus longue entraîne l'identité de HB (Fig.1i).

Nous avons ensuite activé la signalisation SHH pour imposer une identité ventrale aux NSC en traitant les cultures avec l'agoniste Smoothened SAG30 entre 0 et 9 DDC, et avons analysé le sort des cellules exposées à la PR pendant différentes périodes par immunocytochimie ou ARN-seq (Fig. 2a). À 9 DDC, les NSC générés dans des conditions SAG uniquement ou RA1D + SAG exprimaient les marqueurs spécifiques au FB FOXG1, SIX3, SIX6 et LHX2 (Fig. 2b) et le marqueur ventral NKX2.1 (Fig. 2a, b) qui est un marqueur sélectif du télencéphale ventral et du diencéphale31,32. Dans les cultures RA2D + SAG, les marqueurs FB ont été supprimés et les NSC ont adopté une identité LMX1A + / LMX1B + / FOXA2 + / OTX2 + caractéristique des progéniteurs de neurones vMB mDA (Fig. 2a, b, d). Dans les cultures RA4D + SAG, les cellules exprimaient les gènes HOX et les marqueurs ventraux NKX2.2, PHOX2B, NKX6.1 et NKX6.2 typiques des progéniteurs du motoneurone crânien (MN) du HB33 (Fig. 2a, b, d). Les analyses en composants principaux et en clusters hiérarchiques des données d'ARN-seq ont montré une ségrégation claire et de larges changements transcriptionnels entre les cellules exposées à la PR pendant différentes périodes (Fig. 2c et Fig. 2a supplémentaire). Collectivement, ces données établissent d'abord que les augmentations progressives de la durée d'exposition à la PR imposent progressivement plus d'identités cérébrales régionales caudales (FB-> MB-> HB) aux NSC dérivés de hPSC (Fig. 1i). Deuxièmement, lorsqu'elle est combinée avec l'activation de la voie SHH, une impulsion RA de 48 h semble suffisante pour imposer une identité de type LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ vMB aux NSC. La spécification efficace d'une identité de type LMX1A + / FOXA2 + vMB a été atteinte lorsque l'impulsion RA de 48 heures a été initiée entre 0 et 2 DDC (Fig.2b supplémentaire) et lorsque le traitement SAG a été initié à 0 ou 1 DDC (Fig.2c supplémentaire) à une concentration ≥ 50 nM (Fig.2d supplémentaire).

a Schéma de la différenciation des hPSC avec chronologie du traitement avec l'activateur de signalisation RA et SHH (SAG) (en haut). Toutes les cultures ont été différenciées dans des conditions dSMADi, comme indiqué sur la figure 1a. Immunocytochimie pour les marqueurs indiqués à 9 DDC dans des cultures différenciées en condition + SAG et pulsées avec RA pendant 1, 2 ou 4 jours (en bas). b Expression génique normalisée des gènes indiqués dans 9 cultures DDC différenciées en + SAG et traitées avec RA pendant le temps indiqué (n = 2 expériences indépendantes par condition). c Carte thermique et regroupement hiérarchique des gènes exprimés de manière différentielle de 9 cultures DDC différenciées en + SAG et traitées avec RA pendant le temps indiqué (n = 2 expériences indépendantes par condition). d Schéma des profils d'expression génique définissant des progéniteurs ventraux distincts dans le diencéphale (Di), le mésencéphale (MB) et le cerveau postérieur (HB). e Expression de gènes associés aux progéniteurs régionaux indiqués à 14 DDC dans des cultures différenciées en + SAG + RA2D dans deux expériences indépendantes. f Immunocytochimie représentative pour β-CATENIN (à gauche) et boîtes à moustaches des niveaux nucléaires de β-CATENIN (à droite) dans 2 cultures DDC différenciées en + SAG (contrôle) et traitées avec RA ou CHIR99021. Données de la boîte à moustaches : la ligne centrale définit la médiane, la boîte indique le quartile 1 au quartile 3 et les moustaches indiquent une plage interquartile de ± 1,5 x. n = 227 (contrôle), 247 (RA), 232 (CHIR99021) cellules examinées sur 3 différenciations indépendantes, valeurs p dérivées du test t bilatéral non apparié. g Immunocytochimie pour les marqueurs indiqués dans les cultures à 14 DDC différenciées en dSMADi + SAG + RA2D. h Analyse qPCR d'un panel de 17 gènes pour six différenciations mDA indépendantes à 14 DDC (colonne RA2D + SAG ; différenciations #1-#6). Les échantillons de mDA ont été comparés à des cultures différenciées selon une identité de progéniteur de cerveau antérieur (RA0D + SAG, n = 2) ou de cerveau postérieur (RA4D + SAG, n = 2). i Quantification du pourcentage de cellules exprimant FOXA2, LMX1A ou NKX2.1 dans 14 cultures DDC différenciées en +RA2D + SAG sur quatre lignées hPSC différentes (valeurs, moyenne ± ET, n = 3–4). Barres d'échelle : 100 µm dans les panneaux (a, g), 25 µm panneau (f).

Une identité LMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+ a longtemps été considérée comme une caractéristique moléculaire pour les progéniteurs vMB générant des neurones mDA, mais il a été démontré que cette identité était également partagée par les progéniteurs ventraux du diencéphale caudal donnant naissance aux neurones du noyau sous-thalamique (STN)17,32 (Fig. 2d). BARHL1, BARHL2, PITX2 et NKX2.1 sont exprimés sélectivement par la lignée STN et peuvent donc être utilisés pour faire la distinction entre les progéniteurs STN diencéphaliques et les progéniteurs vMB32. Les analyses des cultures RA2D + SAG après 14 jours ont montré que la grande majorité des cellules LMX1A+ co-exprimaient FOXA2, OTX2 et LMX1B ainsi que le marqueur vMB CORIN34 (Fig. 2g ; LMX1A+FOXA2+ : 92,5 % ± 3,3, OTX2+ : 97,3 % ± 1,7, moyenne ± ET, n = 4). À ce stade, un sous-ensemble mineur de cellules avait initié l'expression de NURR1 (Fig. 2g), un marqueur précoce des neurones mDA post-mitotiques35. Les données d'ARN-seq ont montré une expression négligeable de BARHL1, BARHL2, PITX2 et NKX2.1 (Fig. 2e) et de rares NSC LMX1A + ou LMX1B + co-exprimant NKX2.1, PITX2 ou BARHL1 (Fig. 2g; NKX2.1 + : 2,1 % ± 2 (n = 3), PITX2+ : 1,4 ± 0,8 (n = 2) ; moyenne ± SD) dans 14 cultures DDC. L'expression de NKX2.2, PHOX2B, PHOX2A et NKX6.1, seuls ou en combinaison, définissent les progéniteurs à l'origine des motoneurones crâniens (MN) et des neurones sérotoninergiques (5HTN) dans le HB ventral33,36, ou des neurones oculomoteurs37 et des neurones GABAergiques38 dérivés latéral aux neurones mDA dans le MB (Fig. 2d). Les données d'ARN-seq ont révélé une faible expression de ces marqueurs dans les cultures RA2D + SAG (Fig. 2e) et peu de cellules exprimaient NKX2.2, PHOX2A, PHOX2B et NKX6.1 à 14 DDC, comme déterminé par immunocytochimie (Fig. 2g). Les analyses qPCR de six réplicats biologiques de cultures RA2D + SAG isolées à 14 DDC ont indiqué une spécification vMB cohérente et une faible expression de marqueurs régionaux inappropriés (Fig. 2h).

La signalisation WNT1 et FGF8 émanant de l'organisateur isthmique impose un gradient caudal-haut à rostral-bas d'expression EN1 et EN2 dans le MB39,40. EN1, EN2, WNT1, FGF8 et les marqueurs isthmiques PAX2, PAX5 et PAX8 ont été exprimés à des niveaux très faibles ou indétectables à 14 DDC (Fig. 2e). L'activation de la signalisation canonique WNT par CHIR99021 est associée à la translocation de la β-caténine dans les noyaux12,21 (Fig. 2f). Il n'y avait pas d'accumulation nucléaire de β-caténine en réponse au traitement RA (Fig. 2f) et aucune induction de WNT1 ou du gène de réponse WNT AXIN2, ni de FGF8 en réponse à RA dans les cultures ESC à 2 DDC à 14 DDC (Fig. 2e et Fig. 2e supplémentaire) Ensemble, cela suggère que les cellules LMX1A + / FOXA2 + / OTX2 + induites par RA et SAG acquièrent une identité vMB de type EN1 - / LOW et que la spécification du destin de vMB peut se produire indépendamment de WNT1, FGF8 ou induction de cellules de type organisateur isthmique dans des cultures de hPSC.

Ensuite, nous avons comparé la réponse de structuration au traitement RA2D + SAG pour une lignée hESC supplémentaire HS401 ainsi que deux lignées hiPSC SM55 et SM56. Pour chaque lignée cellulaire analysée à 14 DDC, nous avons observé une induction cohérente des progéniteurs LMX1A + / FOXA2 + / OTX2 + / NKX2.1− vMB à haut rendement sans qu'il soit nécessaire d'ajuster la concentration ou le temps d'exposition à la PR (Fig. 2i et Fig. 3 supplémentaire), ce qui nécessiterait normalement un nouveau titrage des agents de structuration à l'aide d'autres protocoles de neurones mDA où CHIR est utilisé pour la caudalisation15. Collectivement, ces données suggèrent que la différenciation basée sur l'AR favorise une spécification vMB robuste et reproductible avec une cohérence inter-expérimentale élevée et une faible variabilité de la lignée cellulaire.

Pour comprendre l'activité de structuration robuste de RA, nous avons examiné la sortie de structuration en réponse à des concentrations modifiées de RA. Dans ces expériences, des cellules cultivées dans des conditions RA2D + SAG ont été exposées à RA dans la plage de 100 à 800 nM, et l'identité régionale des cellules a été analysée à 9 DDC. Dans les cultures exposées à 200-400 nM RA, la grande majorité des NSC exprimaient une identité LMX1A+/NKX2.1− vMB et peu de cellules exprimaient une identité diencéphalique LMX1A+/NKX2.1+ ou NKX2.2+/LMX1A− HB-like identité (Fig. 3a, c). Il est à noter que certains LMX1A + à 9 DDC co-expriment NKX2.2 à des niveaux très bas (Fig. 2c supplémentaire), ce qui est cohérent avec les données montrant que NKX2.2 est exprimé de manière transitoire dans les progéniteurs vMB aux premiers stades de développement in vivo37. Des progéniteurs LMX1A + / NKX2.1− vMB ont également été générés lorsque la concentration de RA a été réduite à 100 nM ou augmentée à 800 nM de RA, mais à un rendement inférieur (Fig. 3c). Lorsque nous avons utilisé CHIR pour spécifier l'identité vMB, les cellules ont atteint une identité LMX1A + / NKX2.1− vMB en réponse à 1 µM CHIR, mais l'identité régionale des NSC s'est déplacée vers un caractère diencéphalique antérieur LMX1A + / NKX2.1 + lorsque la concentration a été réduite à 0, 8 et 0, 6 µM (Fig. 3b, c) ou dans une identité présumée HB postérieure NKX2.2 + / LMX1A− lorsque la concentration a été portée à 1, 2 et 1, 4 µM (Fig. 3b, c). Ces données démontrent que la spécification de l'identité régionale de vMB est relativement tolérante aux concentrations RA modifiées et que c'est plutôt la durée d'exposition à RA qui est centrale pour la structuration robuste de vMB.

a–c Effet des modifications de la concentration de RA (a) ou de CHIR99021 (b) sur l'expression des marqueurs définissant le cerveau antérieur ventral (NKX2.1+LMX1A+), le cerveau moyen (NKX2.1−LMX1A+) ou le cerveau postérieur (NKX2.2+) 9 cultures DDC différenciées en dSMADi+SAG, et quantification correspondante des populations NKX2.1+LMX1A+ et NKX2.1−LMX1A+ (n = 3 différenciations indépendantes par condition). valeurs, moyenne ± ET (c). d Effet de la concentration de RA (50, 100, 300, 500 et 1000 nM RA) sur l'expression du CYP26A1 dans 1 cultures DDC différenciées en dSMADi (données de deux différenciations indépendantes). e Profil d'expression temporelle du CYP26A1 dans des cultures différenciées en dSMADi et pulsées sans AR ou 300, 500 ou 1000 nM d'AR pendant 2 jours (données de deux différenciations indépendantes). f Effet de l'inhibition de l'activité CYP26 avec 500 nM d'inhibiteur R115866 sur l'expression de NKX2.1, LMX1A et PHOX2B à 9 DDC dans des cultures différenciées en SAG et indiquées dans des conditions de PR. g Expression génique relative des gènes indiqués dans 9 cultures DDC différenciées en condition RA1D + SAG et en présence de différentes concentrations de l'inhibiteur du CYP26 R115866 (données de deux différenciations indépendantes). h, i Immunocytochimie de NKX2.1, LMX1A et PHOX2B à 9 DDC dans des cultures différenciées dans dSMADi plus les conditions indiquées (500 nM 9-cis-RA, 13-cis-RA et TA ; 200 nM EC23) et en présence ou absence de 500 nM de R115866. j Résumé schématique des interactions réglementaires entre la PR et le CYP26A1. Barres d'échelle 100 µm.

La famille de gènes CYP26 (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1) code pour des enzymes de la famille du cytochrome p450 qui métabolisent la PR par oxydation41. Le CYP26A1 est exprimé par le neuroectoderme le plus rostral et contribue à prévenir une extension rostrale de l'identité HB aux premiers stades du développement neural26. De plus, dans la structuration antéro-postérieure de l'HB, la régulation par rétroaction négative de la signalisation RA par dégradation auto-améliorée via l'induction des protéines CYP26 est essentielle pour façonner les gradients RA et pour tamponner les fluctuations des niveaux de RA. Nous avons observé une activation dépendant de la concentration de PR et un profil d'expression temporelle adaptative du CYP26A1 dans les cultures de hPSC (Fig. 3d, e). Cela fournit une justification mécaniste plausible pour la réponse de structuration robuste des hPSC à la PR, car l'entrée modifiée de la PR peut être tamponnée par un changement correspondant du taux de renouvellement de la PR par le CYP26A1. Pour explorer cela, nous avons examiné la sortie de structuration en réponse à une exposition chronométrée à la PR après inhibition de l'activité du CYP26 avec l'antagoniste sélectif R11586644 entre 0 et 3 DDC. Dans les cultures RA1D + SAG ou RA2D + SAG traitées avec 500 nM de R115866, les cellules ont acquis une identité PHOX2B+ HB au lieu d'une identité NKX2.1+ FB ou LMX1A+/NKX2.1− vMB à 9 DDC, respectivement (Fig. 3f). HOXA2 et HOXB4 ont été induits dans ces expériences suggérant une identité HB caudale (Fig. 3g), qui correspond à une identité régionale acquise après quatre jours d'exposition à la PR si la fonction CYP26 est laissée intacte (Fig. 1h). Lorsque la concentration de R115866 a été réduite à 100 nM, le destin de FB a été supprimé mais les cultures contenaient un mélange de cellules LMX1A + / NKX2.1− vMB et de cellules PHOX2B + HB (Fig. 3g et Supplémentaire Fig. 4a), reflétant vraisemblablement qu'une inhibition partielle de Le CYP26A1 produit un effet caudalisant intermédiaire. Il est important de noter que le traitement des cellules uniquement avec R115866 et SAG n'a pas supprimé le destin NKX2.1 + FB (Fig. 3f), établissant que le fort effet caudalisant de R115866 dépend de l'AR.

Comme l'AR tout-trans, l'AR 9-cis, l'AR 13-cis et l'acide tazaroténique (TA) analogue à l'AR xénobiotique sont des substrats pour l'oxydation médiée par le CYP2645,46. L'exposition des cellules à 500 nM de ces analogues pendant 48 heures a imité l'activité de structuration de la PR tout-trans en imposant une identité LMX1A + / NKX2.1− vMB (Fig. 3h et Supplémentaire Fig. 4b), et l'inhibition de l'activité CYP26 a résulté dans un passage à une identité PHOX2B + HB (Fig. 3h). L'analogue synthétique EC23 de l'AR devrait être résistant à l'oxydation médiée par le CYP2647 et lorsque l'AR tout-trans a été remplacé par 200 nM d'EC23, les cellules cultivées dans les conditions EC231D + SAG ou EC232D + SAG ont adopté une identité PHOX2B + HB à la fois avec ou sans inhibition du CYP26 (Fig. 3i et Fig. 4a supplémentaire). Des expériences de titrage ont montré que EC23 pouvait induire des cellules LMX1A + / NKX2.1− vMB, mais cela était imprécis et nécessitait une réduction de 20 fois de la concentration et un traitement des cellules uniquement pendant 24 h (Fig. 4c supplémentaire). Ensemble, ces données établissent que la sortie de la modélisation de l'AP en réponse à une exposition chronométrée à l'AR dépend de manière critique de l'activation dépendante de la concentration de l'AR du CYP26A1 dans les hPSC répondants, et fournit une justification mécaniste pour expliquer la robustesse et la tolérance à l'entrée RA modifiée dans l'AR- spécification vMB médiée (Fig. 3j).

Une caractéristique unique des neurones mDA est qu'ils proviennent de cellules initialement non neuronales de la plaque de sol (FP) et que les progéniteurs doivent donc acquérir un potentiel neuronal avant la différenciation en neurones34,48. Peu de marqueurs distinguent ces stades de maturation vMB, mais la régulation négative de SHH et la régulation positive des protéines bHLH pro-neurales au fil du temps sont en corrélation avec cette transition48. Les analyses ARN-seq des cellules traitées RA2D + SAG isolées à 9, 12, 14 et 21 DDC ont montré que l'expression des marqueurs pan-FP SHH, CORIN, ARX, VTN, FERD3L, NTN1, SLIT2, SULF2 et ALCAM a culminé à autour de 12-14 DDC et a ensuite diminué (Fig. 4a, Fig. 5a supplémentaire et Tableau supplémentaire 2). Inversement, NEUROG2, NEUROG1, NEUROD4 et ASCL1 codant pour les protéines bHLH pro-neurales ont été régulés positivement à 21 DDC (Fig. 4a) ainsi que les marqueurs neuronaux mDA NR4A2 (NURR1) et TH, et les marqueurs pan-neuronaux DCX, TUBB3, et STMN2 (Fig. 4a et tableau supplémentaire 2). Les analyses immunocytochimiques ont confirmé que l'expression de SHH était plus élevée à 14 DDC qu'à 21 DDC et que le nombre de progéniteurs NEUROG2 + augmentait au cours de cette période (Fig. 4b). Il y avait une accumulation progressive de neurones HuC/D+ entre 14 et 21 DDC (Fig. 4c, d), et à 21 DDC, environ 30 % des cellules DAPI+ représentaient les neurones HuC/D+ dans les cultures RA2D + SAG (Fig. 4d) . Beaucoup d'entre eux avaient également initié l'expression de TH (Fig. 4c). Lorsque nous avons appliqué CHIR + SAG pour spécifier les progéniteurs LMX1A + / NKX2.1− vMB (Fig. 3b), les cellules ont initié la neurogenèse à environ 17 DDC (Fig. 4c, d), ce qui est cohérent avec les études précédentes13,15. À 21 DDC, les neurones HuC / D + constituaient environ 10% des cellules totales et peu de neurones exprimaient TH (Fig. 4c, d). Des résultats similaires ont été observés lorsque les cultures traitées au CHIR + SAG ont été complétées par un traitement au FGF8b entre 9 et 16 DDC15,17 (Fig. 4c). Cela indique que les progéniteurs vMB spécifiés par RA initient la neurogenèse tôt et que les cellules au niveau de la population subissent une conversion relativement coordonnée d'un état FP immature à un état progéniteur neuronal mDA neurogène.

a–r Analyse des cultures différenciées en dSMADi+RA2D + SAG (a, b, e–r) ou dSMADi+SAG et indiquant la condition RA, CHIR99021 ou CHIR99021 + FGF8 (c, d). a Valeurs de changement de pli log2 basées sur RNAseq de l'expression des gènes associés à l'identité de la plaque de sol et à la neurogenèse à 21 DDC par rapport à 14 DDC. Valeurs P et FDR dans le tableau supplémentaire 2, données de deux expériences indépendantes (n = 2). b Immunocytochimie SHH, LMX1A et NEUROG2 à 14 et 21 DDC. c Immunocytochimie du marqueur neuronal HuC/D à 17 DDC et du marqueur neuronal dopaminergique TH à 21 DDC dans les conditions indiquées. d Quantification des neurones HuC/D+ à 14, 17 et 21 DDC dans les conditions indiquées (n = 2). e–i Immunocytochimie des marqueurs indiqués (e, f, h) et quantifications des cellules TH+ exprimant FOXA2 ou LMX1B (n = 4 et n = 5, respectivement) (g), et des dopaminergiques (TH+, n = 7), GABAergiques (GABA+, n = 6), neurones moteurs (PRPH+, n = 7) et sérotoninergiques (5-HT+, n = 7) à 33–35 DDC. i Valeurs, moyennes ± images SDTH/Tuj et 5-HT/Tuj en (h) correspondent à une triple immunocytochimie 5-HT/TH/Tuj. j, l Immunocytochimie des marqueurs indiqués dans 40 à 45 cultures DDC. k Graphiques en violon de la longueur des neurites (ligne centrale, moyenne ; valeur p du test de Wilcoxon par paire) et de la quantification de la ramification des neurites (ligne centrale, moyenne) dans 30 et 40 neurones DDC TH+, n = 40 neurones par point de temps. m qPCR des marqueurs mDA lors de la différenciation mDA (n = 3, sauf pour 21 DDC où n = 2). n Quantification des cellules TH+ exprimant EN1 à 35–40 DDC (n = 3). Données en (m,n) en tant que moyenne ± SD o Détection HPLC de la noradrénaline (NA), de la dopamine (DA) et de la sérotonine (5-HT) dans le surnageant de 42 cultures DDC. p Quantification des niveaux de dopamine dans les milieux à 42 DDC dans le contrôle (n = 12) ou après la libération de dopamine induite par KCL (n = 12), et dans le lysat cellulaire total (n = 6). Valeurs présentées sous forme de moyenne ± SEM, valeur p du test t bilatéral non apparié. q Enregistrement attaché aux cellules, montrant les potentiels d'action spontanés (à gauche) et les potentiels d'action spontanés isolés (à droite) des cellules à 40–45 DDC. Les pointes de flèches grises indiquent des pointes spontanées. r Immunocytochimie pour TH sur neurone marqué à la biocytine (à gauche) et train de pointes évoquées (à droite) dans 40 neurones DDC. Résumé schématique de la chronologie de différenciation. Barres d'échelle : 100 µm en (b, c, e, h, j) et 50 µm (f, l, r).

Les neurones TH + spécifiés par RA ont acquis une morphologie neuronale progressivement plus avancée avec une excroissance progressive et une ramification des processus axonaux entre 30 et 45 DDC (Fig. 4e, j, k). Les neurones TH + exprimaient les marqueurs neuronaux mDA LMX1B, LMX1A, FOXA2, NURR1 et OTX2 à 30–35 DDC (Fig. 4 e – g). Seules de rares cellules exprimaient Ki67 ou la phospho-histone H3 à 35–40 DDC (Fig. 5b supplémentaire), indiquant une faible activité mitotique dans les cultures à long terme. ~ 80% de tous les neurones ont exprimé TH + à 35 DDC (Fig. 4h, i). ~ 10% des neurones exprimaient GABA (Fig. 4h, i), et certains d'entre eux co-exprimaient TH (Fig. 5b supplémentaire). Seuls de rares neurones exprimant la 5-HT ou le marqueur MN PRPH ont été détectés (Fig. 4h, i). Il a été confirmé que les quatre lignées hPSC examinées dans cette étude donnaient lieu à une teneur élevée en neurones TH + (~ 60 à 80% du total des neurones) dans des cultures à long terme (Fig. 5c supplémentaire).

Les analyses temporelles de l'expression de l'ARNm ont révélé une régulation à la hausse notable de EN1 dans les cultures ESC à 40 DDC (Fig. 4m) et une petite fraction de neurones TH + (~ 15%) exprimaient EN1 détectable sur la base de l'immunocytochimie (Fig. 4l, n). En conséquence, alors que les progéniteurs immatures vMB de type rostral spécifiés par RA montrent une expression EN1 négligeable (Fig. 4m), cela indique que EN1 devient régulé à la hausse dans la différenciation des neurones mDA au fil du temps (voir également ci-dessous). Les cellules ont également exprimé les marqueurs de maturation des neurones mDA DAT, GIRK2, SYNAPTOPHYSIN, CALB1, SOX6, VMAT2 et ALDH1A1 à 40 DDC, tel que déterminé par immunocytochimie (Fig. 4l et Supplémentaire Fig. 5b, d) ou expression d'ARNm (Fig. 4m). Les analyses par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) à 42 DDC ont établi que les neurones produisaient et libéraient de la dopamine (Fig. 4o, p), mais pas de la sérotonine (5-HT) ni de la noradrénaline (NA) (Fig. 4o). Le moment où les cellules dérivées de hPSC acquièrent des potentiels d'action spontanés, des potentiels d'action évoqués et des courants Na + et K + dépendants de la tension fournissent une autre mesure pour évaluer l'état de maturation des neurones mDA in vitro49. Dans les cultures RA2D + SAG, le nombre de cellules patchées présentant des courants Na + et K + dépendants de la tension était faible à 35 DDC mais augmentait considérablement à 38 DDC et restait à un niveau largement constant par la suite (Fig. 6 supplémentaire), et les neurones présentant spontanée (Fig. 4q) ou des potentiels d'action évoqués (Fig. 4r) ont été enregistrés à 40–45 DDC. Collectivement, ces données établissent que les progéniteurs vMB spécifiés par RA se différencient en neurones mDA fonctionnels à haut rendement in vitro (Fig. 4s), avec peu de contamination des sous-types neuronaux générés à proximité des neurones mDA dans le tronc cérébral en développement.

Pour déterminer les performances in vivo des progéniteurs vMB spécifiés en réponse à RA2D + SAG, nous avons transplanté des préparations vMB dans un modèle préclinique de rat de PD50. Les progéniteurs vMB ont été isolés à 14 DDC (Fig. 4s) et greffés au striatum de rats athymiques (nus) avec une lésion unilatérale antérieure de 6-OHDA au faisceau médial du cerveau antérieur comme décrit précédemment 17 (Fig. 7a supplémentaire). Sept mois après la transplantation, l'analyse immunohistochimique a montré que les neuf rats avaient des greffes riches en neurones survivantes avec une innervation étendue des régions cibles de la DA, y compris le striatum dorsolatéral et le cortex préfrontal (Fig. 5a). Les greffons contenaient un grand nombre de neurones TH + (4300 ± 47 neurones TH + par greffon, Fig. 5b) co-marqués avec le marqueur humain HuNu (Fig. 5c, d et Supplémentaire Fig. 7b). Les neurones TH + dérivés de la greffe ont également co-exprimé FOXA2, LMX1A / B, PITX3, NURR1 et EN1 (Fig. 5e – j), indiquant qu'ils ont également adopté un phénotype mDA après la transplantation. ~ 70% des neurones TH + exprimaient EN1 détectable après la greffe, ce qui montre qu'une majorité de neurones mDA spécifiés par RA exprimaient EN1 après différenciation et maturation in vivo (Fig. 5n). ≥ 70 % des neurones TH + ont également co-exprimé PITX3 ainsi que GIRK2 et SOX6, qui sont des marqueurs enrichis en sous-type thérapeutique A9 de neurones mDA51 (Fig. 5i – l, n). L'identité A9 était en outre soutenue par les fibres TH + innervant le striatum dorsolatéral environnant (Fig. 5a et Fig. 7c supplémentaire). L'innervation a également été détectée dans le cortex préfrontal et une petite fraction de neurones TH + exprimait CALB1 (20, 5% ± 4, 7, moyenne ± SD) (Fig. 5m, n), un marqueur enrichi en sous-types A10 de neurones mDA51. La fonctionnalité des neurones TH + a été évaluée à l'aide de tests moteurs induits par des médicaments et spontanés; Test de rotation et de progression induit par l'amphétamine, qui a démontré une récupération fonctionnelle 7 mois après la transplantation (Fig. 5o–q). Ensemble, ces résultats montrent que les progéniteurs vMB dérivés de hPSC spécifiés par RA et SAG se greffent avec succès, étendent les projections aux zones cibles pertinentes et se différencient en neurones mDA fonctionnels qui rétablissent les déficits moteurs dans un modèle animal de MP à un degré comparable à ce qui a été rapporté à partir de cellules générées à l'aide de protocoles de structuration basés sur CHIR13,17,52,53.

a–m Analyse immunohistologique de rats lésés unilatéralement par la 6-OHDA sept mois après la greffe de préparations de vMB dans le striatum. a Vue d'ensemble de l'innervation dérivée du greffon vers le cerveau de l'hôte étiqueté avec une coloration hNCAM développée par DAB et un grossissement de l'excroissance des fibres neuronales humaines vers le cortex préfrontal (PFC) et le striatum dorsolatéral (DLstr). b Expression TH dans le striatum et la substance noire (SN). Notez l'immuno-réactivité TH dans tout le striatum et l'absence d'expression TH dans le SN du côté lésé (à droite). c–m Immunohistochimie des marqueurs indiqués dans les greffons. n Quantification du pourcentage de cellules TH+ dans les greffons exprimant EN1, SOX6, GIRK2 (n = 6 rats), PITX3 ou CALB1 (n = 4 rats). Données présentées sous forme de moyenne ± SD o Quantification des rotations nettes par minute chez les rats avec des scores de rotation induits par les amphétamines ≥ 5 tours ipsilatéraux par minute (n = 5 rats) après la lésion et sept mois après la transplantation. Données présentées sous forme de moyenne ± SEM, valeur p du test t bilatéral à variance inégale de Welch. p Comportement rotationnel dans le temps après administration d'amphétamine avant (lignes pleines) et sept mois après (lignes pointillées) la greffe de tous les animaux greffés (n = 9 rats). q Préférence pour l'utilisation de la patte controlatérale après la lésion et sept mois après la transplantation. Données présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 9 rats). o–q les mêmes rats analysés après la lésion ont été analysés sept mois après la transplantation. Barres d'échelle : 1000 µm en (a). à gauche et (b), 100 µm dans (a). droite; 25 µm dans (d, e, f, I, j, k); 10 µm en (c, g, h, l, m).

Alors que notre étude se concentre sur la spécification basée sur l'AR des neurones mDA, l'exposition chronométrée à l'AR devrait être largement applicable pour la spécification de divers types de neurones cliniquement pertinents des hPSC. Par exemple, une exposition prolongée à la PR (≥ 3 jours) associée à l'activation de la voie SHH induit des progéniteurs de type NKX2.2+ HB (Fig. 2a, b) qui sont connus pour générer séquentiellement des motoneurones crâniens PHOX2B+ (MN) et des neurones sérotoninergiques (5HTN ) au cours du développement de la souris et de l'homme36,54. Étant donné que les 5HTN modulent un large éventail de processus et de comportements physiologiques et sont impliqués dans la physiopathologie d'un éventail de troubles psychiatriques55,56, nous avons examiné si le traitement chronométré de la PR pouvait également fournir une stratégie pour la production de 5HTN humains16,55 (Fig. 6a ). La fenêtre temporelle sur laquelle les MN sont produits est définie par la co-expression de NKX2.2 et du déterminant MN PHOX2B dans les progéniteurs57. Dans les cultures RA4D + SAG, NKX2.2 et PHOX2B ont été co-exprimés entre ~ 9 et 16 DDC (Fig. 6b) et il y a eu une accumulation progressive de MN différenciateurs au cours de cette période, comme déterminé par la présence de PHOX2B + / NKX2. 2− cellules à 17 DDC et neurones PHOX2B+/PRPH+/ISL1+/ISL2+ et PHOX2B+/TuJ1+ à 19 DDC (Fig. 6b). Au 17ème JDC, PHOX2B était régulé à la baisse dans la plupart des progéniteurs NKX2.2 + et les cellules exprimant le marqueur de lignée 5HTN GATA3 avaient commencé à émerger (Fig. 6b), indiquant que les progéniteurs avaient subi un changement de destin MN vers 5HTN à cette époque. Pour réduire la quantité de MN nés précocement en culture, nous avons introduit une étape de dissociation à 24 DCC, car les neurones différenciés montraient une capacité inférieure à se rattacher à la boîte de culture par rapport aux précurseurs immatures (Fig. 6a). En utilisant cette méthode, nous avons pu réduire le nombre de MN PHOX2B + en culture à 34 DDC à ~ 6% (Fig. 6c, d) et atteindre des cultures dans lesquelles ~ 60 à 65% des neurones HuC / D + totaux exprimaient 5-HT et molécules. marqueurs caractéristiques des 5HTN tels que GATA3, LMX1B, la tryptophane hydroxylase 2 (TPH2), le transporteur de la sérotonine (SERT) et l'autorécepteur 5-HT1A (5-HT1AR) (Fig. 6c – e). Ensemble, ces données fournissent une preuve de concept que la durée chronométrée de l'exposition à la PR peut être appliquée pour une dérivation in vitro efficace des 5HTN humains.

un résumé schématique des conditions de différenciation et de la chronologie des processus lors de la génération de MN et de 5HTN. b Immunocytochimie de NKX2.2, PHOX2B et GATA3 à 9 et 17 DDC, et de Tuj1, PRPH, PHOX2B et ISL1/2 à 19 DDC dans des cultures traitées avec RA4D + SAG. c Immunocytochimie pour la sérotonine (5-HT) avec MAP2, GATA3 ou PHOX2B à 34 DDC. d Quantification des cellules HuC/D+ exprimant PHOX2B, GATA3 ou GATA3 et 5-HT, à 34 DDC (n = 3 différenciations indépendantes). Données représentées sous forme de moyenne ± SD e Immunocytochimie des marqueurs indiqués dans les 5HTN à 35-45 DDC. Barres d'échelle : 100 µm dans les panneaux (b, c) et 50 µm dans le panneau (e).

Un objectif central de la recherche sur les cellules souches est le développement de techniques de différenciation simples et robustes permettant une production reproductible du produit cellulaire souhaité avec un rendement et une pureté élevés58. Dans cette étude, nous présentons une approche alternative pour la dérivation de neurones mDA humains transplantables qui est principalement différente des protocoles de neurones mDA basés sur hPSC à la pointe de la technologie, car elle utilise la signalisation RA au lieu de CHIR99021 ou CHIR99021 et FGF8 pour imposer Identité MB aux progéniteurs neuronaux dérivés de hPSC. Lorsqu'elle est combinée avec l'activation de la voie SHH, une impulsion RA de 48 heures se traduit par une spécification cohérente des progéniteurs vMB avec une contamination négligeable des cellules exprimant les identités diencéphaliques ou du cerveau postérieur. Les progéniteurs vMB spécifiés par RA subissent des étapes de différenciation et de maturation progressives compatibles avec le développement normal des neurones mDA, ce qui se traduit par un rendement élevé de neurones mDA exprimant des caractéristiques fonctionnelles dans des cultures à long terme.

Nous montrons que la RA est suffisante pour imposer progressivement plus d'identités cérébrales caudales d'une manière comparable à l'activation progressive de la signalisation canonique WNT par CHIR99021. Cependant, une caractéristique distinctive avec la structuration basée sur RA est que la spécification régionale est définie par la durée d'exposition au signal et que la réponse de structuration est relativement insensible aux concentrations RA modifiées. RA diffère dans cet aspect de la plupart des signaux morphogènes développementaux qui spécifient différents destins à différentes concentrations, y compris WNT12,16. Nous pourrions attribuer la tolérance à des niveaux variables d'entrée de RA à une boucle de rétroaction négative dans laquelle les fluctuations de l'entrée de RA sont contrebalancées par des changements correspondants dans le taux de renouvellement de RA par le CYP26A143. Ce circuit de régulation est crucial pour une spécification régionale fiable car la réponse de structuration a été perturbée après l'inhibition pharmacologique du CYP26A1. En conséquence, ces caractéristiques réglementaires confèrent robustesse et reproductibilité à la procédure de différenciation et devraient contribuer à réduire le besoin d'ajustements de lot à lot et de ligne à ligne. Cela pourrait faciliter les différenciations lorsque plusieurs lignées hiPSC sont envisagées pour une utilisation clinique ou la modélisation de maladies in vitro2,8, ainsi que des efforts d'intensification lorsqu'un grand nombre de cellules sont nécessaires. De plus, outre la promotion du destin des neurones mDA, nous montrons qu'une durée prolongée d'exposition à la PR pourrait être utilisée pour produire des MN et des 5HTN crâniens indiquant une large applicabilité du paradigme de différenciation. Alors que notre étude établit fermement que RA est suffisant pour spécifier le destin mésencéphalique indépendant de la signalisation WNT et FGF8, une étude précédente a exploité une combinaison RA, WNT1, FGF8a et SHH pour la dérivation basée sur hPSC des neurones mDA59. Dans cette étude, un rendement d'environ 1 % de neurones FOXA2+/TH+ a été observé dans des cultures à long terme, mais les neurones FOXA2+/TH+ ont été perdus lorsque WNT1 a été sélectivement omis de la procédure de différenciation. L'utilisation de RA dans ce cadre particulier n'était par conséquent pas suffisante pour spécifier le sort des neurones mDA, et cela pourrait plutôt être attribué à la signalisation WNT.

Nous avons constaté qu'une exposition précoce à la PR, dans le cadre d'un traitement par dSMADi, favorise également une conversion rapide et semblable à un interrupteur des hPSC OCT4+/SOX1− en NSC OCT4−/SOX1+. Cette activité a un effet synchronisant sur les cellules au niveau de la population et explique vraisemblablement pourquoi les progéniteurs vMB spécifiés par la PR subissent une transition relativement coordonnée d'un état FP à un état neurogène environ 2 à 3 semaines après la fin du traitement de la PR. La dissolution de la pluripotence induite par l'AR est également souhaitable du point de vue de la sécurité, car elle minimise le risque potentiel de réactivation des gènes de pluripotence ou que des cellules sporadiques maintiendraient des traits de pluripotence pendant des périodes plus longues. Cependant, cela dit, il est important de souligner qu'il n'y a pas de rapports d'effets secondaires indésirables tels que la prolifération cellulaire après des évaluations précliniques approfondies ou à partir d'expériences cliniques initiées utilisant les protocoles de neurones mDA précédents60,61.

Lorsqu'ils sont greffés dans le striatum de rats lésés par la 6-OHDA, les progéniteurs vMB spécifiés par RA se greffent, se différencient en neurones mDA matures qui survivent à long terme et restaurent la fonction motrice. Une majorité de neurones TH+ présents dans les greffons exprimaient EN1, notamment puisque EN1 est nécessaire à la survie à long terme des neurones mDA chez la souris62,63. Étant donné que nos analyses in vitro établissent une expression négligeable d'EN1 dans les progéniteurs vMB spécifiés par RA (Figs. 2e, 4m), nous n'avons pas examiné EN1 dans la préparation utilisée pour la greffe. Nous ne pouvons donc pas conclure formellement que ce lot manquait d'expression EN1, ce qui pourrait potentiellement influencer le nombre de neurones EN1+/TH+ générés. Cependant, comme une régulation à la hausse de EN1 est observée dans un sous-ensemble de neurones mDA relativement jeunes in vitro, il semble plus plausible que la proportion élevée de neurones EN1+/TH+ dans les greffes reflète une activation progressive de EN1 dans la maturation des neurones mDA spécifiés par RA au fil du temps. La quantification de SOX6, PITX3 et GIRK2 dans les greffons indique en outre que la majeure partie des neurones mDA spécifiés par RA expriment une identité de sous-type de type A9. Ainsi, la spécification vMB basée sur RA offre une voie alternative potentielle pour générer des cellules pour la thérapie cellulaire dans la MP. Dans cette étude de transplantation initiale, nous avons isolé des progéniteurs vMB pour la greffe à un jeune état FP, ce qui a fourni une preuve de concept importante que les neurones mDA générés à l'aide d'un protocole basé sur RA fonctionnent à égalité avec les neurones mDA générés à l'aide de protocoles basés sur CHIR13,17,52 ,53.

Comme les cellules spécifiées par RA subissent une différenciation relativement synchronisée, il sera passionnant d'explorer dans les expériences futures si la greffe de progéniteurs vMB isolés à d'autres stades de maturation pourrait potentiellement améliorer le rendement, la fonction et l'innervation des neurones mDA, ou la composition des greffons64. L'identification de RA en tant qu'agent de structuration MB fournit en outre un outil supplémentaire pour explorer si l'utilisation combinatoire de signaux de structuration peut améliorer la qualité des préparations, comme indiqué précédemment pour le développement progressif des protocoles de neurones mDA basés sur CHIR99021/FGF8. Par exemple, des protocoles CHIR récents ont utilisé le FGF817 ou un second CHIR-boost18 pour réduire les progéniteurs diencéphaliques indésirables dans les préparations en promouvant une identité de progéniteur caudale EN1+ vMB, ce qui a amélioré les résultats de la greffe. Les progéniteurs spécifiés par RA acquièrent une identité vMB de type EN1- plus rostrale sans aucune contamination significative des cellules diencéphaliques, ce qui a également entraîné un bon résultat de greffe. Par rapport à cela, il est à noter qu'il existe une distribution topologique inégale des sous-types de neurones mDA le long de l'axe rostro-caudal du MB adulte, et avec une concentration de sous-types A9 rostralement51,66. Dans quelle mesure cela se rapporte à l'origine positionnelle de la naissance des neurones reste incertain, mais puisque RA impose une identité vMB de type rostrale tandis que CHIR et FGF8 favorisent des identités vMB de type caudale17,18, il sera intéressant d'explorer si le sous-modèle des progéniteurs vMB par l'utilisation combinatoire de ces signaux peut être utilisé pour moduler la composition du sous-type de neurones mDA dans les greffes. De plus, comme la RA agit en amont des signaux émanant de l'organisateur isthmique, il est concevable que l'activation séquentielle de la signalisation RA et WNT dans les cultures hPSC imite plus étroitement le développement embryonnaire normal qui pourrait être bénéficiaire à la fois en termes de rendement et d'efficacité fonctionnelle de la mDA dérivée de hPSC. neurones après greffe.

Les lignées ESC humaines (HS980 et HS401)67 ont été fournies par les Drs. Outi Hovatta et Fredrik Lanner (Institut Karolinska). Les lignées iPSC humaines (SM55 et SM56) ont été fournies par les Drs Pamela J. McLean et Simon Moussaud (Neuroregeneration Lab au sein du Center for Regenerative Medicine, Mayo Clinic). L'isolement des fibroblastes cutanés primaires humains (obtenus avec le consentement du patient) et la génération d'iPSC ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel de la Mayo Clinic dans le cadre des protocoles IRB (IRB 09-003803). Les cellules ont été maintenues sur des plaques revêtues de vitronectine humaine recombinante (VTN) (Thermo Fisher Scientific) dans du milieu iPS-Brew XF (Miltenyi Biotech). Les cellules ont été passées avec de l'EDTA (0, 5 mM) et un inhibiteur de ROCK a été ajouté au milieu à une concentration finale de 10 µM pendant les 24 premières heures après le placage. Toutes les lignées cellulaires ont été testées négatives pour la contamination par les mycoplasmes. Toutes les différenciations ont été réalisées à l'aide de la lignée hESC HS980, sauf indication contraire.

Pour la différenciation des PSC, des cultures de PSC confluentes à 80–90% ont été rincées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), traitées avec de l'EDTA (0, 5 mM dans du PBS) pendant 5 à 7 min et remises en suspension dans une suspension cellulaire unique dans du PBS. Les cellules ont été centrifugées à 400 g et remises en suspension dans du milieu N2B27 (DMEM/F12 : Neurobasal (1:1), suppléments 0,5 × N2 et 0,5 x B27 (plus vitamine A), 1 × acides aminés non essentiels, 1 % GlutaMAX, 55 µM β-mercaptoéthanol - tous de Thermo Fisher Scientific) contenant 5 μM de SB431542 (Miltenyi Biotech) et 2,5 μM de DMH1 (Santa Cruz Biotech) (double inhibition SMAD) et 10 μM d'inhibiteur ROCK (pour les 48 premières heures après l'ensemencement). Les cellules ont été ensemencées sur une surface revêtue de VTN (2 μg/cm2) et de fibronectine (FN) (2 μg/cm2) (Sigma) à une densité de 60 000 à 80 000 cellules/cm2 pour les expériences basées sur les analogues RA et RA, et 20 000 cellules /cm2 pour les expériences CHIR99021. SAG1.3 (Santa Cruz Biotechnology), CHIR99021 (Miltenyi Biotech), all-trans RA, 9-cis RA, 13-cis RA, acide tazaroténique, R115866 (tous Sigma), EC23 (Amsbio) ont été utilisés à des concentrations et des points de temps décrit dans la section des résultats. Les analogues tout-trans RA et RA ont été dissous dans du DMSO (solution mère 10 mM), aliquotés à l'abri de la lumière et utilisés dans un délai d'un mois. Les aliquotes ont été conservées à -20 °C et utilisées une seule fois.

Pour la différenciation des neurones mDA (voir schéma à la Fig. 4), les progéniteurs neuronaux ont été mécaniquement dissociés à 9 DDC avec Stem Cell Passaging Tool (Thermo Fisher Scientific) et ensemencés à un rapport de 1: 3 dans du milieu N2B27 contenant 10 µM d'inhibiteur de ROCK (pendant les 48 premières heures après dissociation) sur les surfaces revêtues de VTN et FN. Pour la différenciation terminale in vitro des neurones dopaminergiques, les cellules ont été dissociées à 23 ou 24 DDC avec de l'accutase (Thermo Fisher Scientific) et étalées (600 000 à 800 000 cellules/cm2) sur VTN + FN + Laminine (2 μg/cm2 chacune) (Sigma) surface revêtue dans du milieu B27+ (Thermo Fisher Scientific) additionné de BDNF (10 ng/ml) et GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech), acide ascorbique (0,2 mM) (Sigma), inhibiteur de ROCK 10 µM (Miltenyi Biotech) (pendant les 48 premières heures après la dissociation). Pour l'électrophysiologie et l'analyse du contenu en neurotransmetteurs, les cellules ont été cultivées dans du milieu d'électrophysiologie B27 (Thermo Fisher Scientific) additionné de BDNF (10 ng/ml) et de GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech), d'acide ascorbique (0,2 mM) (Sigma) et Inhibiteur ROCK 10 µM (pendant les 48 premières heures après la dissociation) pendant au moins 5 jours avant l'expérience. Le milieu était systématiquement changé tous les 2 à 3 jours.

Pour la différenciation MN et 5HTN (voir schéma de la Fig. 6), les cellules ont été remises en suspension dans du milieu N2B27 contenant 5 μM de SB431542 et 2,5 μM de DMH1 et 10 μM d'inhibiteur de ROCK (pendant les 48 premières heures après l'ensemencement) et ensemencées sur VTN + FN ( 2 μg/cm2 chacun) surface enduite à une densité de 60 000 à 80 000 cellules/cm2. Les cellules ont été traitées avec 200 nM de RA ou EC23 pendant les quatre premiers jours. 200 nM de SAG1.3 ont été ajoutés au milieu de différenciation de 2 à 9 DDC. Les cultures ont été dissociées mécaniquement à 9 DDC avec Stem Cell Passaging Tool, remises en suspension dans du milieu N2B27 contenant 10 µM d'inhibiteur ROCK (pendant les 48 premières heures après la dissociation) et ensemencées à un rapport de 1: 3 sur des surfaces revêtues de VTN + FN. Pour la différenciation terminale in vitro des 5HTN, les cellules ont été dissociées à 23 ou 24 DDC avec de l'accutase et étalées (600 000 à 800 000 cellules/cm2) sur VTN + FN + Laminine (2 μg/cm2 chacun) surface enduite dans un milieu B27+ additionné de 10 ng /ml de BDNF, 10 ng/ml de GDNF, 0,2 mM d'acide ascorbique, 10 µM d'inhibiteur de ROCK (pendant les 48 premières heures après la dissociation) et 10 µM de DAPT. Le milieu était systématiquement changé tous les 2 à 3 jours.

Les cellules ont été fixées pendant 12 min. à température ambiante (TA) dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, rincé trois fois dans du PBST (PBS avec 0,1 % de Triton-X100) et bloqué pendant 1 h à TA avec une solution de blocage (3 % FCS/0,1 % de Triton-X100 dans du PBS ). Les cellules ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C, suivies d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à un fluorophore pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps secondaires primaires et conjugués au fluorophore ont été dilués dans une solution de blocage. Des anticorps secondaires conjugués à Alexa (488, 555, 647) appropriés (sondes moléculaires) ont été utilisés. L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit avant 17. Les anticorps primaires et secondaires utilisés sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 4.

Les images d'immunofluorescence ont été acquises avec un microscope confocal Zeiss LSM 700 avec le logiciel ZEN 2011, un microscope à fluorescence Zeiss AxioImager M2 avec le logiciel ZEN2 et Molecular Devices ImageXpress Micro (version logicielle 6.0), et analysées avec l'open-source ImageJ/Fiji (v1.53) , CellProfiler (v3.1.5) ou MetaXpress (v 5.0).

L'ARN total a été isolé à l'aide du kit Quick-RNA Mini Prep Plus (Zymo Research). L'ADNc a été préparé en utilisant le kit de synthèse d'ADNc Maxima First Strand (Thermo Fisher Scientific). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée dans un cycleur thermique du système de PCR en temps réel rapide 7500 en utilisant le Fast SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). L'analyse de l'expression génique a été réalisée à l'aide de la méthode 2-ΔΔCt, où l'expression relative des gènes a été normalisée aux niveaux de transcrit GAPDH. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 3.

Pour le séquençage d'ARN Illumina, l'intégrité de l'ARN a été déterminée sur une puce Agilent RNA 6000 Pico, à l'aide d'Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies). Le kit d'ARNm Illumina TruSeq Stranded avec sélection Poly-A a été utilisé pour la construction de la bibliothèque. Les échantillons ont été séquencés sur les instruments NovaSeq6000 et HiSeq2500 avec une configuration 2×51. La conversion Bcl vers FastQ a été effectuée à l'aide de bcl2fastq_v2.19.1.403 de la suite logicielle CASAVA. Les lectures ont été mappées sur l'assemblage du génome humain, construit GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/] en utilisant STAR (v 2.6.1a)68. Les abondances au niveau des gènes ont été estimées en tant que FPKM à l'aide de StringTie269. Le résumé de lecture pour chaque gène (c'est-à-dire le nombre) a été calculé à l'aide de featureCounts70. Plusieurs identifiants de gène ENSEMBL ont été additionnés par symbole de gène HUGO connu. L'expression différentielle a été estimée à partir des valeurs FPKM transformées en log. La signification statistique de l'expression différentielle a été estimée avec le test t de la fonction R, en utilisant les valeurs p et le taux de fausses découvertes (package R v. 3.6.2), en supposant une variance inégale et en appliquant la modification des degrés de liberté gallois. Selon la configuration expérimentale, la conception a été considérée comme appariée ou non appariée. Les valeurs p résultantes de l'expression différentielle étaient accompagnées de valeurs de changement de pli respectives. Les valeurs de p ont été ajustées pour les tests multiples en calculant le taux de fausses découvertes (FDR) par la méthode de Benjamini et Hochberg71.

Le traçage de la carte thermique et la visualisation PCA ont été effectués avec des outils en ligne (version bêta) sur [https://www.evinet.org/]72 en utilisant les paramètres standard du package R heatmaply et la fonction princompas back-end.

Les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA (Sigma) complété par un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase (ThermoFisher Scientific) et incubées sur de la glace sous agitation pendant 30 min. Le lysat a été clarifié par centrifugation (20 000 g pendant 20 min à 4 ° C) et la concentration en protéines a été déterminée par dosage de l'acide bicinchoninique (BCA). Le lysat protéique a été remis en suspension dans un tampon LDS (Thermo Fisher Scientific) contenant 2,5 % de 2-mercaptoéthanol et dénaturé à 95 °C pendant 5 min. 15 à 30 μg de protéines ont été chargés par voie d'un gel de polyacrylamide SDS à 4 à 15% (Bio-Rad) et transférés sur des membranes de nitrocellulose (BioRad) à l'aide du système Trans-Blot Turbo (BioRad). Les membranes ont été incubées dans une solution de blocage (TBS avec 0, 1% de Tween-20 (TBST) et 5% de lait en poudre écrémé) pendant 1 h à température ambiante, suivie d'une incubation d'une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires. Après 3 lavages avec du TBST à température ambiante, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 1 h à température ambiante. La détection de HRP a été réalisée par un substrat chimiluminescent SuperSignal West Dura et le signal a été détecté sur un système d'imagerie ChemiDoc (Bio-Rad). Les anticorps primaires pour l'immunotransfert sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 4.

Les concentrations de noradrénaline (NA), de dopamine (DA) et de sérotonine (5-HT) dans 42 cultures DDC ont été déterminées par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec détection électrochimique.

Des cultures à 42 DDC différenciées en dSMADi+RA2D ont été incubées en solution physiologique (NaCl 140 mM ; KCl 2,5 mM ; MgCl2 1 mM ; CaCl2 1,8 mM ; tamponné avec HEPES (20 mM) à pH 7,4) ou en solution à haut K+ (solution physiologique avec 56 mM de K+, et la concentration en ions Na+ a été réduite proportionnellement pour garder la même osmolarité totale). Après 20 min (min.), les solutions d'incubation ont été recueillies et utilisées pour l'analyse du contenu en neurotransmetteurs. Pour déterminer la teneur en neurotransmetteurs cellulaires, les cellules ont été lysées dans H2O. Les solutions d'incubation et les lysats cellulaires ont été déprotéinés avec de l'acide perchlorique 0,1 M et après 15 min. incubation sur glace, les échantillons ont été centrifugés deux fois à 20 000 g pendant 15 min. comme décrit précédemment73. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode BCA. Les échantillons ont ensuite été analysés dans un système HPLC composé de HTEC500 (Eicom, Kyoto, Japon) et d'un microéchantillonneur réfrigéré CMA/200 (CMA Microdialysis, Stockholm, Suède) équipé d'une boucle de 20 μl et fonctionnant à +4 °C. Le potentiel de l'électrode de travail en carbone vitreux était de + 450 mV par rapport à l'électrode de référence Ag/AgCl. La séparation a été réalisée sur une colonne Eicompak CAX 200 × 2,0 mm (Eicom). La phase mobile était un mélange de méthanol et de tampon phosphate 0,1 M (pH 6,0) (30:70, v/v) contenant 40 mM de chlorure de potassium et 0,13 mM d'EDTA-2Na. Les chromatogrammes ont été enregistrés et intégrés à l'aide du système informatisé d'acquisition de données Clarity (DataApex).

La longueur moyenne des neurites a été quantifiée à l'aide du plugin NeuronJ dans le package ImageJ74 [https://imagej.net/plugins/neuronj] sur des images immunofluorescentes de neurones TH+ (grossissement 10x, zoom 0,5). Le nombre de branches par neurone a été calculé à l'aide d'images immunofluorescentes de neurones TH + à un grossissement plus élevé, 20x.

Des lames contenant des neurones âgés de 35 à 60 jours ont été placées dans une chambre d'enregistrement contenant un milieu d'électrophysiologie (Neurabasal Medium, Electro; Thermo Fisher Scientific). Pour l'enregistrement, les neurones ont été visualisés à l'aide d'un microscope DIC (Scientifica, Uckfield, Royaume-Uni) avec un objectif 60x (Olympus, Tokyo, Japon). Des pipettes patch (résistance de 3 à 5 MΩ pour les enregistrements à pince de tension, de 5 à 10 MΩ pour les enregistrements à pince de courant), tirées sur un extracteur de micropipette P-87 Flaming/Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA), ont été remplies soit de 154 Solution de NaCl mM pour les enregistrements de pince de tension ou solution de KCl 120 mM contenant 8 mM de biocytine pour les enregistrements de pince de courant. Les signaux ont été enregistrés avec un amplificateur Axon MultiCalmp 700B et numérisés à 20 kHz avec un numériseur Axon Digidata 1550B (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). La résistance d'accès et la capacité de la pipette ont été compensées. Les enregistrements de pince de tension attachés à la cellule ont été filtrés passe-bande à 2 Hz bas / 1 kHz haut et les événements montrant une hyperpolarisation après ont été considérés comme des potentiels d'action spontanés. Pour évaluer les schémas de dopage, les neurones enregistrés en mode pince de courant ont été maintenus à un potentiel de membrane de -60 mV. Des pas de courant proches du seuil ont été appliqués pour déterminer le courant de rhéobase, puis des pas de courant de 1 s proportionnels au courant de rhéobase ont été appliqués. La présence de courants Na+ et K+ a été déterminée en mode voltage clamp en appliquant un pas de tension avec des intervalles de 10 mV à partir d'un maintien de -60 mV. Les courants ont été mesurés depuis la ligne de base (10 ms avant le début de l'étape de tension) jusqu'au pic de la composante de courant Na+ rapide caractéristique ou au pic de la composante de courant K+ lente. Les propriétés électriques ont été extraites à l'aide d'un script Matlab personnalisé (MathWorks, Natick, MA, USA) [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY]. Après l'enregistrement, les lames ont été fixées, colorées et imagées comme décrit ci-dessus. La biocytine a été visualisée à l'aide de Streptavidin Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific).

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément à la directive de l'Union européenne (2010/63/UE) et ont été approuvées par le comité d'éthique de Malmö/Lund pour l'utilisation d'animaux de laboratoire (Malmö/Lunds djurförsöksetiska nämnd) et le ministère suédois de l'agriculture (Jordbruksverket ). Des rats femelles adultes "nus" athymiques ont été achetés auprès des laboratoires Harlan / Envigo (Hsd: RH-Foxn1rnu) et ont été hébergés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau, sous un cycle lumière / obscurité de 12 heures. Les animaux étaient au minimum de 16 semaines au début de l'expérience (180 g). Les procédures chirurgicales et la lésion de la voie nigro-striée par une seule injection unilatérale de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans le faisceau médial du prosencéphale droit (MFB) ont été réalisées comme décrit précédemment75. En bref, les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie générale en utilisant une solution de fentanyl et de médétomidine (20:1) injectée par voie intrapéritonéale (1 ml/kg ; Apoteksbolaget, Suède). La lésion de la voie nigrostriée chez des rats "nus" a été induite par injection unilatérale de 6-hydroxydopamine dans le MFB droit, avec un volume de 4 µL à une concentration en base libre de 3,5 mg/mL aux coordonnées suivantes par rapport au bregma : A/P − 4 ; M/L -1,2 ; D/V (de la dure-mère) −7,5. La sévérité des lésions a été mesurée quatre semaines après l'injection de 6-OHDA par des rotations induites par l'amphétamine enregistrées sur 90 min à l'aide d'un système automatisé (Omnitech Electronics)17 et par un test de progression13. La rotation induite par l'amphétamine a été induite par injection intrapéritonéale de 2,5 mg/kg de chlorhydrate d'amphétamine (Sigma). Huit semaines après la lésion 6-OHDA MFB, les rats "nus" ont reçu une dose totale de 150 000 progéniteurs dérivés de CSEh au jour 14 de différenciation dans le striatum comme décrit précédemment75. En bref, un volume de 2 µL de suspension cellulaire (les cellules à une concentration de 75 000 cellules/µL ont été injectées à un débit de 1 µL par minute suivi d'un temps de diffusion de 2 minutes) a été injecté dans le striatum aux coordonnées suivantes par rapport au bregma : A/P + 0,5 ; M/L-3 ; D/V (de la dure-mère) -4,5 ; ajusté à tête plate. La rotation induite par l'amphétamine et le test de progression ont été évalués 7 mois après la greffe. Les animaux ont été perfusés après analyse comportementale puis traités pour l'immunohistochimie.

Les valeurs P ont été calculées à l'aide du test t de Student, du test t de variance inégale de Welch ou du test de Wilcoxon par paires et ont été effectuées pour l'analyse statistique de deux groupes. Les méthodes statistiques utilisées sont indiquées dans les légendes des figures correspondantes.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Données sources pour les Fig. 1 à 6 et Figs supplémentaires. 1 à 7 sont fournis avec ce document. Les ensembles de données RNA-seq rapportés dans ce manuscrit ont été déposés dans Gene Expression Omnibus sous le numéro d'accession GSE147404. Assemblage du génome humain, build GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/].

Le script et les données pour l'analyse des propriétés électriques des neurones sont disponibles sur [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY].

Rowe, RG & Daley, GQ Cellules souches pluripotentes induites dans la modélisation des maladies et la découverte de médicaments. Nat. Révérend Genet. 20, 377–388 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barker, RA, Parmar, M., Studer, L. et Takahashi, J. Essais sur l'homme de neurones dopaminergiques dérivés de cellules souches pour la maladie de Parkinson : l'aube d'une nouvelle ère. Cellule souche cellulaire 21, 569–573 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Björklund, A. & Lindvall, O. Remplacement des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson : comment cela s'est-il passé ? J. Parkinson. Dis. 7, S21–S31 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, TW, Koo, SY & Studer, L. Thérapies par cellules souches pluripotentes pour la maladie de Parkinson : défis actuels et opportunités futures. Devant. dév. Biol. 8, 729 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Doi, D. et al. Étude préclinique de cellules progénitrices dopaminergiques dérivées de cellules souches pluripotentes induites pour la maladie de Parkinson. Nat. Commun. 11, 3369 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Parmar, M. & Grealish, S. L'avenir des thérapies par cellules souches pour la maladie de Parkinson. Nat. Rév. Neurosci. 21, 103–115 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Song, B. et al. Les progéniteurs dopaminergiques autologues humains dérivés d'iPSC restaurent la fonction motrice dans les modèles de la maladie de Parkinson. J.Clin. Investir. 130, 904–920 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taylor, CJ, Peacock, S., Chaudhry, AN, Bradley, JA & Bolton, EM Génération d'une banque iPSC pour la transplantation de tissus compatibles HLA basée sur les types HLA connus du donneur et du receveur. Cellule souche cellulaire 11, 147-152 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Deuse, T. et al. Les dérivés hypoimmunogènes des cellules souches pluripotentes induites échappent au rejet immunitaire chez les receveurs allogéniques totalement immunocompétents. Nat. Biotechnol. 37, 252-258 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chambers, SM et al. Conversion neuronale hautement efficace des cellules ES et iPS humaines par double inhibition de la signalisation SMAD. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tao, Y. & Zhang, S.-C. Spécification de sous-type neuronal à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cellule souche cellulaire 19, 573–586 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kirkeby, A. et al. Génération de progéniteurs neuraux et de neurones fonctionnels spécifiés au niveau régional à partir de cellules souches embryonnaires humaines dans des conditions définies. Cell Rep. 1, 703–714 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kriks, S. et al. Les neurones dopaminergiques dérivés de cellules ES humaines se greffent efficacement dans des modèles animaux de la maladie de Parkinson. Nature 480, 547-551 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Gantner, CW, Cota-Coronado, A., Thompson, LH & Parish, CL Un protocole optimisé pour la génération de neurones dopaminergiques du mésencéphale dans des conditions définies. Protocole STAR 1, 100065 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Nolbrant, S., Heuer, A., Parmar, M. & Kirkeby, A. Génération de progéniteurs dopaminergiques du mésencéphale ventral humain de haute pureté pour la maturation in vitro et la transplantation intracérébrale. Nat. Protocole 12, 1962-1979 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lu, J. et al. Génération de neurones à sérotonine à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Nat. Biotechnol. 34, 89–94 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kirkeby, A. et al. Les marqueurs prédictifs guident la différenciation pour améliorer les résultats de la greffe dans la traduction clinique de la thérapie à base de CSEh pour la maladie de Parkinson. Cellule souche cellulaire 20, 135–148 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, TW et al. L'activation biphasique de la signalisation WNT facilite la dérivation des neurones dopaminergiques du mésencéphale à partir des CSEh pour une utilisation translationnelle. Cellule souche cellulaire 28, 343–355.e5 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maimaitili, M. et al. Production accrue de neurones dopaminergiques mésencéphaliques à partir de cellules souches humaines indifférenciées restreintes à la lignée. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.09.28.462222 (2021).

Bain, J. et al. La sélectivité des inhibiteurs de protéine kinase : une nouvelle mise à jour. Biochimie. J. 408, 297–315 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Toledo, EM, Gyllborg, D. & Arenas, E. Traduction des programmes de développement WNT en stratégies de remplacement des cellules souches pour le traitement de la maladie de Parkinson. Br. J. Pharmacol. 174, 4716–4724 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibbs, HC, Chang-Gonzalez, A., Hwang, W., Yeh, AT & Lekven, AC Morphogenèse de la limite du mésencéphale et du cerveau postérieur : à l'intersection de la signalisation Wnt et Fgf. Devant. Neuroanat. 11, 1–17 (2017).

Article CAS Google Scholar

Jovanovic, VM et al. La voie BMP/SMAD favorise la neurogenèse des neurones dopaminergiques du mésencéphale in vivo et dans les cellules souches pluripotentes et neurales induites par l'homme. J. Neurosci. 38, 1662-1676 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monzel, AS et al. Dérivation d'organoïdes spécifiques au mésencéphale humain à partir de cellules souches neuroépithéliales. Rapports sur les cellules souches 8, 1144–1154 (2017).

Halilagic, A., Zile, MH et Studer, M. Un nouveau rôle pour les rétinoïdes dans la structuration du cerveau antérieur aviaire au cours des stades présomites. Développement 130, 2039–2050 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Uehara, M. et al. CYP26A1 et CYP26C1 régulent de manière coopérative la structuration antéro-postérieure du cerveau en développement et la production de cellules de la crête neurale crânienne migratrices chez la souris. Dév. Biol. 302, 399-411 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Avantaggiato, V., Acampora, D., Tuorto, F. & Simeone, A. L'acide rétinoïque induit une restructuration spécifique au stade du système nerveux central rostral. Dév. Biol. 175, 347–357 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gonzales, KAU et al. Restriction déterministe sur la dissolution de l'état pluripotent par les voies du cycle cellulaire. Cellule 162, 564-579 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Diez del Corral, R. et al. Les voies opposées du FGF et des rétinoïdes contrôlent le modèle neuronal ventral, la différenciation neuronale et la segmentation pendant l'extension de l'axe du corps. Neurone 40, 65–79 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Frank-Kamenetsky, M. et al. Modulateurs à petites molécules de la signalisation Hedgehog : identification et caractérisation des agonistes et antagonistes de Smoothened. J. Biol. 1, 1–19 (2002).

Article Google Scholar

Ericson, J., Muhr, J., Jessell, TM & Edlund, T. Sonic hedgehog : un signal commun pour la structuration ventrale le long de l'axe rostrocaudal du tube neural. Int. J. Dev. Biol. 39, 809-816 (1995).

CAS PubMed Google Scholar

Kee, N. et al. L'analyse unicellulaire révèle une relation étroite entre la dopamine différenciée et les lignées neuronales du noyau sous-thalamique. Cellule souche cellulaire 20, 29–40 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pattyn, A. et al. Contrôle temporel et spatial coordonné de la génération de neurones moteurs et de neurones sérotoninergiques à partir d'un pool commun de progéniteurs du SNC. Gènes Dév. 17, 729–737 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ono, Y. et al. Différences de potentiel neurogène dans les cellules de la plaque de plancher le long d'un emplacement antéropostérieur : les neurones dopaminergiques du mésencéphale proviennent des cellules de la plaque de plancher mésencéphalique. Développement 134, 3213–3225 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Zetterström, RH et al. Agénésie des neurones dopaminergiques chez des souris déficientes en Nurr1. Sciences 276, 248-250 (1997).

Article PubMed Google Scholar

Dias, JM, Alekseenko, Z., Applequist, JM et Ericson, J. La signalisation Tgfβ régule la neurogenèse temporelle et la puissance des cellules souches neurales dans le SNC. Neurone 84, 927–939 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Deng, Q. et al. Rôles spécifiques et intégrés de Lmx1a, Lmx1b et Phox2a dans le développement du mésencéphale ventral. Développement 138, 3399–3408 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kala, K. et al. Gata2 est un gène sélecteur post-mitotique tissu-spécifique pour les neurones GABAergiques du mésencéphale. Développement 136, 253–262 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, A. & Joyner, AL Modèle antérieur/postérieur précoce du mésencéphale et du cervelet. Annu. Rév. Neurosci. 24, 869–896 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hynes, M. & Rosenthal, A. Spécification des neurones dopaminergiques et sérotoninergiques dans le SNC des vertébrés. Courant. Avis. Neurobiol. 9, 26–36 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Thatcher, JE & Isoherranen, N. Le rôle des enzymes CYP26 dans la clairance de l'acide rétinoïque. Avis d'expert. Médicament Metab. Toxicol. 5, 875–886 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

White, RJ & Schilling, TF Comment dégrader: Cyp26s dans le développement du cerveau postérieur. Dév. Dyn. 237, 2775–2790 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schilling, TF, Nie, Q. & Lander, AD Dynamique et précision dans les gradients de morphogène d'acide rétinoïque. Courant. Avis. Genet. Dév. 22, 562–569 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hernandez, RE, Putzke, AP, Myers, JP, Margaretha, L. & Moens, CB Les enzymes Cyp26 génèrent le schéma de réponse de l'acide rétinoïque nécessaire au développement du cerveau postérieur. Développement 134, 177–187 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Foti, RS et al. Identification de l'acide tazaroténique comme premier substrat xénobiotique de l'hydroxylase de l'acide rétinoïque humain CYP26A1 et CYP26B1. J. Pharmacol. Exp. Là. 357, 281-292 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blanc, JA et al. Identification du cytochrome humain P450, P450RAI-2, qui est principalement exprimé dans le cervelet adulte et est responsable du métabolisme de l'acide rétinoïque tout-trans. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 97, 6403–6408 (2000).

Article CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Lopez-Real, RE et al. L'application de rétinoïdes synthétiques photostables induit de nouveaux phénotypes des membres et du visage au cours de l'embryogenèse du poulet in vivo. J.Anat. 224, 392–411 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Andersson, E. et al. Identification des déterminants intrinsèques des neurones dopaminergiques du mésencéphale. Cellule 124, 393–405 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Riessland, M. et al. La perte de SATB1 induit une sénescence cellulaire dépendante de p21 dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques. Cellule souche cellulaire 25, 514–530.e8 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grealish, S. et al. Les neurones dopaminergiques dérivés d'ESC humaines présentent une efficacité et une puissance précliniques similaires à celles des neurones fœtaux lorsqu'ils sont greffés dans un modèle de rat de la maladie de Parkinson. Cellule souche cellulaire 15, 653–665 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brignani, S. & Pasterkamp, ​​RJ Migration spécifique au sous-ensemble neuronal et mécanismes de câblage axonal dans le système de dopamine du mésencéphale en développement. Devant. Neuroanat. 11, 1–18 (2017).

Article CAS Google Scholar

Niclis, JC et al. Des neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral efficacement spécifiés à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions sans xéno restaurent les déficits moteurs chez les rongeurs parkinsoniens. Cellules souches Trad. Méd. 6, 937–948 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Xiong, M. et al. Les neurones dérivés de cellules souches humaines réparent les circuits et restaurent la fonction neuronale. Cellule souche cellulaire https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.08.014 (2020).

Marklund, U. et al. Analyse détaillée de l'expression des gènes régulateurs dans le tube neural humain en développement précoce. Développement de cellules souches 23, 5–15 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vadodaria, KC, Stern, S., Marchetto, MC & Gage, FH Sérotonine en psychiatrie : modélisation de maladies in vitro à l'aide de neurones dérivés du patient. Tissu cellulaire Res. 371, 161-170 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Okaty, BW, Commons, KG & Dymecki, SM Embrassant la diversité dans le système neuronal 5-HT. Nat. Rév. Neurosci. 20, 397–424 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dias, JM et al. Un motif de minuterie à trois nœuds piloté par Shh/Gli contrôle l'identité temporelle et le sort des cellules souches neurales. Sci. Adv. 6, eaba8196 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Zeltner, N. & Studer, L. Modélisation des maladies à base de cellules souches pluripotentes : obstacles actuels et promesses futures. Courant. Avis. Cell Biol. 37, 102-110 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cooper, O. et al. La différenciation des cellules iPS humaines ES et de la maladie de Parkinson en neurones dopaminergiques du mésencéphale ventral nécessite une forme à haute activité de SHH, FGF8a et une régionalisation spécifique par l'acide rétinoïque. Mol. Cellule. Neurosci. 45, 258-266 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parmar, M. Vers des thérapies à base de cellules souches pour la maladie de Parkinson. Développement 145, dev156117 (2018).

Fan , Y. , Winanto & Ng , S.-Y. Remplacer ce qui est perdu : une nouvelle ère de thérapie par cellules souches pour la maladie de Parkinson. Trad. Neurodégénératif. 9, 2 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sgado, P. et al. Dégénérescence progressive lente des neurones dopaminergiques nigraux chez des souris mutantes Engrailed postnatales. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 103, 15242–15247 (2006).

Article PubMed PubMed Central ADS CAS Google Scholar

Simon, HH, Saueressig, H., Wurst, W., Goulding, MD & O'Leary, DDM Destin des neurones dopaminergiques du mésencéphale contrôlés par les gènes engrailed. J. Neurosci. 21, 3126–3134 (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ásgrímsdóttir, ES & Arenas, E. Développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale au niveau de la cellule unique : in vivo et dans les cellules souches. Devant. Cellule Dév. Biol. 8, 1–20 (2020).

Article Google Scholar

Marton, RM & Ioannidis, JPA Une analyse complète des protocoles pour dériver des neurones dopaminergiques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cellules souches Trad. Méd. 8, 366–374 (2019).

Article PubMed Google Scholar

Veenvliet, JV et al. La spécification des sous-ensembles dopaminergiques implique l'interaction de En1 et Pitx3. Développement 140, 3373–3384 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Main, H., Hedenskog, M., Acharya, G., Hovatta, O. & Lanner, F. Banque de cellules souches embryonnaires humaines de l'Institut Karolinska. Cellule souche Res. 45, 101810 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Dobin, A. et al. STAR : aligneur RNA-seq universel ultra-rapide. Bioinformatique 29, 15-21 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kovaka, S. et al. Assemblage de transcriptome à partir d'alignements d'ARN-seq à lecture longue avec StringTie2. Génome Biol. 20, 1–13 (2019).

Article CAS Google Scholar

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. FeatureCounts : un programme polyvalent efficace pour attribuer des lectures de séquences à des caractéristiques génomiques. Bioinformatique 30, 923–930 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Contrôler le taux de fausses découvertes : une approche pratique et puissante du multiple. Test. Statistique JR. Soc. Ser. B 57, 289-300 (1995).

MathSciNet MATHGoogle Scholar

Jeggari, A. et al. EviNet : une plate-forme Web pour l'analyse de l'enrichissement du réseau avec une définition flexible des ensembles de gènes. Nucleic Acids Res. 46, W163–W170 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, L. & Beal, MF Détermination des niveaux de neurotransmetteurs dans des modèles de la maladie de Parkinson par HPLC-ECD. Méthodes Mol. Biol. 793, 401–415 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pemberton, K., Mersman, B. & Xu, F. Utilisation d'ImageJ pour évaluer la croissance des neurites dans les cultures de cellules de mammifères : exercices de quantification des données de recherche dans un laboratoire de neurosciences de premier cycle. J Undergrad Neurosci Educ. 16, 186-194 (2018).

Adler, AF et al. Les greffes dopaminergiques dérivées de hEsSC s'intègrent dans les circuits des ganglions de la base dans un modèle préclinique de la maladie de Parkinson. Cell Rep. 28, 3462–3473.e5 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nous remercions les Drs. Outi Hovatta et Fredrik Lanner (Karolinska Institutet) pour les lignes hESC, les Drs. Pamela J. McLean et Simon Moussaud, Neuroregeneration Lab au sein du Center for Regenerative Medicine, Mayo Clinic (Mayo Clinic, Jacksonville) pour les lignes hiPSC. Nous reconnaissons le soutien de l'infrastructure nationale de génomique dans la production de génomique, Stockholm pour l'assistance avec le séquençage massivement parallèle et l'accès à l'infrastructure de calcul UPPMAX. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Knut et Alice Wallenberg (KAW2011.0661, KAW2012.0101 ; JE), du Conseil suédois de la recherche (2013-4155, 2017-02089 ; JE), de la Fondation suédoise pour la recherche stratégique (SRL10-0030 ; JE), Hjärnfonden (FO2017-0037, F02019-0154, F02021-0159 ; JE), Parkinson Fonden (1189/19, 1257/20, 1326/21 ; JE), Novo Nordisk Foundation (NNF20OC0062355 ; JE), Karolinska Institutet ( J. E.).

Financement en libre accès fourni par l'Institut Karolinska.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : José M. Dias, Andrew F. Adler, Mariya Kozhevnikova.

Département de biologie cellulaire et moléculaire, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Suède

Zhanna Alekseenko, José M. Dias, Mariya Kozhevnikova, Ashwini Jeggari, Svitlana Vasylovska et Johan Ericson

Neurobiologie développementale et régénérative, Département des sciences médicales expérimentales, Wallenberg Neuroscience Center, Université de Lund, 221 84, Lund, Suède

Andrew F. Adler, Sara Nolbrant et Malin Parmar

Centre de cellules souches de Lund, Université de Lund, 22184, Lund, Suède

Andrew F. Adler, Sara Nolbrant et Malin Parmar

Département des biosciences et de la nutrition, Karolinska Institutet, 141 83, Huddinge, Suède

Josina Anna van Lunteren & Marie Carlén

Département de physiologie et pharmacologie, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Suède

Takashi Yoshitake et Jan Kehr

Pronexus Analytical AB, Bromma, Suède

Jan Kehr

Département de neurosciences, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Suède

Marie Carlen

Département de microbiologie, tumeur et biologie cellulaire, Karolinska Institutet, 171 65, Stockholm, Suède

Andreï Alexeïenko

Science for Life Laboratory, 171 21, Solna, Suède

Andreï Alexeïenko

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ZA : conception et plan d'étude, différenciation et caractérisation des hPSC, analyse et interprétation des données. JMD et MK : manipulation hPSC, différenciation et caractérisation, interprétation des données. AFA : transplantation in vivo, analyses comportementales, analyse des données de transplantation avec contribution du SNJAvL et MC : électrophysiologie et analyse des données. AJ et AA : analyse de données RNA-seq et bioinformatique. SV : ​​différenciation et caractérisation des hPSC. JK et TY : analyse HPLC. Conception de PM et supervision d'études de transplantation. JE : supervision, conception et conception de l'étude, et rédaction du manuscrit avec ZA, JMD, AFA et MP

Correspondance avec Johan Ericson.

Une demande de brevet (n° 2006792.2) relative aux résultats présentés dans l'article a été déposée par JE et ZA avec le soutien de Karolinska Institute Innovations AB. MP est propriétaire de Parmar Cells AB et co-inventeur des brevets suivants WO2016162747A2, WO2018206798A1 et WO2019016113A1. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Alekseenko, Z., Dias, JM, Adler, AF et al. Dérivation robuste de neurones dopaminergiques transplantables à partir de cellules souches pluripotentes humaines par administration chronométrée d'acide rétinoïque. Nat Commun 13, 3046 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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Reçu : 01 février 2021

Accepté : 11 mai 2022

Publié: 01 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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