Induction de la formation de synapses par synthèse de novo de neurotransmetteurs

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3060 (2022) Citer cet article

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Une question vitale en neurosciences est de savoir comment les neurones alignent leurs structures postsynaptiques avec les sites de libération présynaptiques. Bien que les protéines d'adhésion synaptique soient connues pour contribuer à ce processus, le rôle des neurotransmetteurs reste incertain. Ici, nous cherchons à savoir si la biosynthèse de novo et la libération vésiculaire d'un transmetteur non canonique peuvent faciliter l'assemblage de ses post-synapses correspondantes. Nous démontrons que, dans les neurones humains dérivés de cellules souches ainsi que dans les neurones de souris in vivo d'identité purement glutamatergique, l'expression ectopique des enzymes de synthèse du GABA et des transporteurs vésiculaires est suffisante pour produire du GABA à partir du glutamate ambiant et le transmettre à partir des terminaux présynaptiques. Cela permet une accumulation efficace et une activation cohérente des récepteurs GABAA postsynaptiques et génère des synapses GABAergiques entièrement fonctionnelles qui fonctionnent en parallèle mais indépendamment de leurs homologues glutamatergiques. Ces résultats suggèrent que la libération présynaptique d'un neurotransmetteur lui-même peut signaler l'organisation de l'appareil post-synaptique pertinent, qui pourrait être directement modifié pour reprogrammer l'identité synaptique des neurones.

Les neurones communiquent entre eux via des structures spécialisées appelées synapses. La façon dont les synapses établissent et maintiennent leur identité reste largement incertaine. Selon une théorie, les molécules d'adhésion cellulaire synaptique (SAM) déclenchent la formation de synapses en favorisant les interactions trans-synaptiques entre les composants pré- et post-synaptiques1,2,3. À l'appui de cette hypothèse, l'expression ectopique des SAM peut respectivement améliorer ou induire la synaptogenèse dans les neurones et les cellules non neuronales4,5,6,7. De plus, des délétions génétiques individuelles de certains SAM ont également été signalées comme diminuant le nombre de synapses à des degrés variables, bien qu'elles n'aient pas complètement éliminé l'assemblage des synapses8,9,10.

Fait intéressant, malgré ces quelques cas, les modèles de knock-out constitutifs ou conditionnels (KO) pour la grande majorité des SAM ne présentent aucune altération à grande échelle de la formation des synapses et n'affectent que leur maturation fonctionnelle, ce qui peut parfois entraîner une perte ultérieure de synapses au fil du temps11,12,13,14,15. De plus, les mécanismes dépendants de la SAM n'expliquent pas encore les productions de différents types de synapses, car plusieurs SAM postsynaptiques spécifiquement localisés au niveau des synapses principales glutamatergiques ou γ-aminobutyriques (GABA) -ergiques peuvent souvent interagir avec des partenaires de liaison présynaptiques communs qui sont de la même manière. distribués aux deux types de synapse16,17,18. Par conséquent, des signaux cellulaires alternatifs autres que les SAM pourraient être principalement ou simultanément requis pour la synaptogenèse et l'alignement fiable de l'appareil synaptique complémentaire.

Un deuxième modèle de synaptogenèse implique que la libération de neurotransmetteurs peut directement moduler ce processus. En réponse à divers émetteurs produits dans les terminaisons présynaptiques, leurs compartiments postsynaptiques recrutent des classes distinctes de récepteurs qui confèrent des propriétés fonctionnelles aux synapses. Cette théorie est encore renforcée par des études montrant que la suppression des récepteurs GABAA (GABAAR) peut altérer à la fois la morphologie et la spécificité de cible d'un sous-ensemble de synapses GABAergiques19,20. Des preuves supplémentaires d'arrangements postsynaptiques dépendants du transmetteur ont été obtenues à partir d'observations récentes selon lesquelles différents co-transmetteurs synthétisés dans un seul neurone peuvent souvent être séparés au niveau de terminaux présynaptiques indépendants qui entrent en contact avec des populations de cellules postsynaptiques distinctes21,22,23. De plus, certains neurones peuvent même basculer entre les types d'émetteurs d'une manière dépendante de l'activité, ce qui à son tour modifie leurs niveaux de récepteurs correspondants et leurs compositions au niveau des postsynapses24,25.

Le cas le plus convaincant de la synaptogenèse induite par le transmetteur apparaît peut-être à partir de deux études fondamentales démontrant que la photolyse rapide du glutamate «en cage» et du GABA près des branches dendritiques peut provoquer une accumulation locale de récepteurs post-synaptiques et de protéines d'échafaudage, entraînant la formation de synapses immatures qui peuvent éventuellement s'intégrer dans circuits neuronaux existants26,27. Ce phénomène a également été reproduit avec succès dans différents sous-types neuronaux situés dans diverses régions du cerveau d'une large tranche d'âge d'animaux28,29,30. Cependant, on ne sait pas (i) si de tels mécanismes peuvent fonctionner lors de la libération de neurotransmetteurs présynaptiques physiologiquement pertinents, (ii) si ces synapses naissantes induites par le transmetteur subissent une maturation morphologique et/ou fonctionnelle supplémentaire, (iii) si l'identité du transmetteur d'un neurone lui-même pourraient être délibérément manipulés à l'aide de facteurs exogènes, (iv) si la modification du neurotransmetteur libéré pouvait directement conduire à la production de différents types de synapses, et (v) si ces synapses induites par le transmetteur pourraient également se développer in vivo, en particulier chez les animaux vivants. Répondre à ces questions pourrait permettre de comprendre les principes fondamentaux de la formation et de l'acquisition des identités des synapses.

Dans cette étude actuelle, nous avons cherché à déterminer si l'expression ectopique d'enzymes présynaptiques exogènes et de transporteurs vésiculaires peut conduire à la fois la biosynthèse et la libération synaptique d'un transmetteur alternatif dans les neurones engagés dans la lignée, et initier la formation de postsynapses fonctionnelles d'un autre type. Nous avons constaté qu'une surexpression combinatoire de trois protéines, à savoir vGAT, GAD65 et GAD67, peut synthétiser et transmettre de manière adéquate le GABA même à partir de neurones exclusivement glutamatergiques, ce qui déclenche une production efficace de synapses de sortie GABAergiques morphologiquement et fonctionnellement matures, à la fois in vitro et in vivo. .

Nous avons d'abord cherché à comprendre comment les neurones glutamatergiques protègent leur identité de transmetteur aux sorties synaptiques et empêchent d'autres spécifications, par exemple les programmes GABAergiques. À cette fin, nous avons utilisé un système modèle précédemment établi qui génère rapidement des neurones glutamatergiques purs à partir de cellules souches embryonnaires humaines (ES, par exemple la lignée H1) par l'expression forcée d'un seul facteur de transcription, la neurogénine-2 (c'est-à-dire Ngn2 ; Fig. 1a)31 . Les enregistrements de voltage-clamp (potentiel de maintien, Vhold = -70 mV) au jour post-induction ≈ 56–60 ont détecté des courants postsynaptiques spontanés robustes (sPSC) avec des activités de réseau récurrentes (Fig. S2a supplémentaire). Ces événements synaptiques étaient principalement composés de sPSC excitateurs (c'est-à-dire de sEPSC) car ils pouvaient être facilement abolis par l'application aiguë d'un antagoniste du récepteur AMPA (AMPAR) Cyanquixaline (CNQX) mais pas par l'antagoniste GABAAR Picrotoxin (PTX), ce qui implique que Ngn2- les neurones manquent de GABAAR postsynaptiques, de libération de GABA présynaptique ou des deux (Fig. S1a supplémentaire). Cependant, des perfusions de bouffées d'agonistes exogènes dans les mêmes conditions expérimentales ont révélé l'existence de GABAAR entièrement fonctionnels et sensibles au PTX en plus des AMPAR, indiquant que ces neurones ne transmettent que le glutamate mais probablement pas le GABA à partir de leurs terminaux présynaptiques (Fig. S1b supplémentaire) .

une neurogenèse a été induite dans des cellules H1-ES par l'expression lentivirale de Ngn2, co-infectées avec des virus supplémentaires codant vGAT, GAD65 et/ou GAD67 ; les neurones ont été co-cultivés avec de la glie de souris et analysés au jour 56–60. b Un exemple d'image de neurones humains induits par Ngn2 (têtes de flèches cyan) co-transduits avec des facteurs V57, immunomarqués pour MAP2, Synapsin et colorés pour le DAPI nucléaire (têtes de flèches blanches). La population MAP2-négative et colorée au DAPI indique des cellules gliales de souris co-cultivées. En médaillon, cadre pointillé agrandi à droite. c, d Traces d'échantillons de sPSC enregistrées à partir des conditions indiquées c, et fréquence cumulée normalisée des décroissances τ d pour les événements rapides et lents (pointes de flèche bleues ou rouges). Encarts en d, exemples de formes d'onde de 10 sPSC mis à l'échelle et superposés (teinte claire) avec les moyennes correspondantes (teinte foncée) pour le contrôle (en haut) par rapport à V57 (en bas). e, f Fréquence moyenne (à gauche) et amplitude (à droite) des événements sPSC avec une cinétique de désintégration rapide (e, τ-decay < 10 ms) vs lente (f, τ-decay > 10 ms), enregistrée à partir de neurones humains exprimant combinaisons de facteurs indiqués. g, h Traces représentatives g et histogramme cumulatif de la décroissance τ h des sPSC enregistrés à partir de neurones Ngn2 co-exprimant des facteurs V57, avant (Ctrl) et après des traitements aigus avec PTX et/ou CNQX (comme annoté). je–k. Probabilités cumulées (à gauche) et valeurs moyennes (à droite) de la demi-largeur de la sPSC (i), de l'amplitude (j) et de la fréquence des événements (k), mesurées en l'absence (Ctrl) ou en présence d'inhibiteurs, PTX, CNQX ou les deux PTX + CNQX. Toutes les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM, avec le nombre de cellules patchées / lots indépendants. Les points de données individuels sont fournis sous forme de cercles ouverts de couleur assortie. Pour les panels e, f, la signification statistique a été évaluée par le test de Kruskal-Wallis associé au test U post-hoc non paramétrique de Mann-Whitney utilisant la correction de Bonferroni (voir Données sources). Pour i, j, k, les valeurs d'asymétrie et d'aplatissement (-2 >≈ et ≈ < 2) suggèrent une distribution normale, car la signification statistique a été pondérée par un test t de Student bilatéral, non apparié, avec ***P < 0,005 ; **P < 0,01 ; *P < 0,05 ; ns = non significatif, P > 0,05. Plusieurs groupes du panel k ont également été comparés par une analyse de variance (ANOVA unidirectionnelle) associée à un test post-hoc de Tukey-Kramer, et les valeurs P correspondantes ont été rapportées.

Afin d'identifier les machineries pré- ou post-synaptiques essentielles à la neurotransmission GABAergique mais éventuellement manquantes dans les cellules Ngn2 uniquement, nous avons ensuite inspecté les résultats de séquençage d'ARN précédemment obtenus par nous32. Nous avons remarqué la présence de diverses sous-unités GABAAR, ainsi que d'importantes molécules d'échafaudage postsynaptiques inhibitrices (par exemple la géphyrine et la collybistine), mais seulement une expression minimale des glutamate décarboxylases (c'est-à-dire GAD65 et GAD67) ou du transporteur vésiculaire GABA (vGAT) (Fig. S1c supplémentaire ). Ces cellules, cependant, présentaient une expression substantielle d'enzymes associées à la fois à la biosynthèse du glutamate et à la charge vésiculaire (c'est-à-dire la glutaminase et vGLUT1 / 2), confirmant à nouveau leur identité glutamatergique (Fig. S1c supplémentaire). Ainsi, bien que la population de cellules postsynaptiques puisse contenir des composants nécessaires à l'assemblage fonctionnel du GABAAR, les neurones Ngn2 sont largement déficients en enzymes présynaptiques pour la synthèse du GABA et la transmission vésiculaire.

Nous avons ensuite demandé si l'expression forcée de GAD65, GAD67 et/ou vGAT dans les cellules Ngn2 glutamatergiques pouvait synthétiser le GABA à partir du glutamate ambiant et l'emballer dans des vésicules synaptiques pour une libération ultérieure. Nous avons cloné des ADNc humains codant GAD65, GAD67 et vGAT sous le promoteur Synapsin-1 humain, fabriqué des particules de lentivirus à partir des constructions et co-infecté des neurones Ngn2 avec eux (Fig. 1a). Aux jours post-induction 56 à 60, les immunocolorations pour MAP2 dendritique et le marqueur synaptique Synapsin ont révélé une formation substantielle de synapse (Fig. 1b). Fait intéressant, les enregistrements électrophysiologiques de neurones co-exprimant GAD65 + vGAT ou GAD67 + vGAT, mais aucun des deux facteurs seuls, ont significativement diminué la fréquence des sPSC avec une décroissance τ rapide sans affecter leur amplitude, et ont simultanément augmenté à la fois la fréquence et l'amplitude des sPSC avec une désintégration τ plus lente qui était pour la plupart absente des neurones Ngn2 uniquement (Fig. 1c – f). Par conséquent, la co-expression des enzymes de synthèse du GABA avec le transporteur vésiculaire du GABA a produit des événements sPSC probablement d'une identité différente de celle des EPSC typiques. Les effets les plus importants observés concernaient la combinaison vGAT + GAD65 + GAD67 (appelée ci-après V57, Fig. S2b supplémentaire).

Pour déterminer l'identité des événements sPSC avec des désintégrations τ rapides ou lentes, nous avons ensuite appliqué des bloqueurs de récepteurs dans des cellules Ngn2 co-exprimant des facteurs V57. Les traitements aigus de CNQX vs PTX ont empêché sélectivement et respectivement les sPSC rapides vs lents avec des demi-largeurs plus petites vs plus grandes, ce qui suggère qu'ils représentent en conséquence des courants synaptiques excitateurs vs inhibiteurs (c'est-à-dire EPSC vs IPSC; Fig. 1g – i ). Les IPSC spontanés présentaient des amplitudes moyennes considérablement différentes, pouvaient être inhibés indépendamment des EPSC, et seule l'application de PTX + CNQX, mais aucun médicament seul n'était capable d'éliminer tous les événements sPSC (Fig. 1j, k). Ces résultats indiquent que les facteurs V57 peuvent provoquer avec succès la formation de sorties GABAergiques fonctionnelles dans les neurones humains glutamatergiques.

Étant donné que les sPSC pourraient être un mélange de courants postsynaptiques miniatures indépendants du potentiel d'action (AP) (mPSC) et d'activités de réseau dépendantes de l'AP, nous avons cherché à caractériser davantage leurs contributions relatives à la libération de GABA induite par V57. En mode pince de courant, les neurones Ngn2 co-exprimant V57 (appelés NV57) affichaient des AP de base répétitifs, qui étaient facilement abolis par la tétrodotoxine (TTX), révélant des dépolarisations sous-liminaires indiquant des potentiels postsynaptiques miniatures authentiques indépendants de l'AP (c'est-à-dire des mPSP ; Fig .2a, b). En conséquence, dans les enregistrements à voltage imposé, l'application aiguë de TTX a effectivement réduit l'amplitude et la fréquence des sPSC rapides et lents, mais n'a pas complètement éliminé tous les événements (Fig. 2c – e). Un traitement CNQX successif a aboli les mEPSC excitateurs rapides médiés par AMPAR et a illustré la coexistence de mIPSC inhibiteurs induits par GABAAR insensibles au TTX avec des désintégrations τ plus lentes et des demi-largeurs plus larges, qui pourraient par conséquent être réduits au silence par le traitement PTX (Fig. 2f -h). Ainsi, les terminaux présynaptiques induits par V57 ont présenté une libération spontanée de GABA de manière dépendante de l'AP et indépendante de l'AP, activant avec succès les GABAAR postsynaptiques.

a Enregistrements en pince de courant de points d'accès spontanés, en l'absence (Ctrl, à gauche) ou en présence de TTX (à droite). Encarts, zones agrandies des régions encadrées avec AP (astérisque noir) ou dépolarisation sous-seuil (astérisque violet). b Fréquence moyenne de la PA spontanée (à gauche) ou de la dépolarisation totale (à droite), sans (Ctrl) ou avec TTX. c. Traces représentatives de sPSC (zones encadrées agrandies ci-dessous) enregistrées en mode voltage-clamp à partir de la condition Ctrl par rapport aux traitements aigus de TTX, pointes de flèches pointant vers des événements avec décroissance τ rapide (bleu) contre lente (rouge). d, e Diagrammes de probabilité et moyennes de l'amplitude de l'événement (à gauche) et de la fréquence (à droite) pour sEPSC d ou sIPSC e. f Traces représentatives de mPSC enregistrées en présence de TTX uniquement (Ctrl), ou après co-application soit de CNQX, soit de PTX, soit des deux (CNQX + PTX). Les pointes de flèche indiquent les événements EPSC rapides (bleu) par rapport aux événements IPSC lents (rouge). g, h Fréquence normalisée de la décroissance τ pour les événements PSC miniatures g ; Encart = 10 traces d'échantillons superposées (nuances claires) et leurs moyennes correspondantes superposées (nuances sombres). Graphiques de probabilité cumulée des demi-largeurs d'événements avec des graphiques récapitulatifs h, pour les mEPSC résistants au PTX (bleu) par rapport aux mIPSC résistants au CNQX (rouge). i Formes d'onde représentatives superposées (gauche, artefacts de stimulus remplacés par des flèches), amplitudes moyennes (milieu) et CV (droite) des PSC évoqués par> = 3 impulsions présynaptiques consécutives, telles qu'enregistrées à partir des conditions indiquées. j Exemple de traces (à gauche) d'EPSC et d'IPSC évoquées par train d'impulsions (flèches) ; Les encarts sont des stimulations appariées successives d'entrées présynaptiques avec ∆t = 50 ms, présentées sous forme d'essais superposés (6 impulsions appariées consécutives, teintes claires) avec des traces moyennes (teintes foncées). Toutes les amplitudes PSC normalisées à la 1ère impulsion correspondante (à droite). Les EPSC et les IPSC ont tous deux manifesté une dépression synaptique significative, mais d'une ampleur différente, peut-être en raison de différents degrés de désensibilisation et / ou de saturation des AMPAR postsynaptiques par rapport aux GABAAR, et ne pouvaient donc pas être directement comparés en tant que proxy pour les probabilités de libération présynaptique. Toutes les données numériques sont des moyennes ± SEM, avec le nombre total de neurones enregistrés/lots expérimentaux, et les points de données tracés sous forme de cercles ouverts. Les significations statistiques ont été évaluées soit par le test t de Student bilatéral, non apparié (valeurs d'asymétrie et d'aplatissement −2 > ≈ et ≈ < 2), soit par le test U bilatéral non paramétrique de Mann-Whitney, pour ***P < 0,005 ; *P < 0,05 ; ns = non significatif, P > 0,05. Plusieurs groupes ont été comparés par ANOVA unidirectionnelle (i, avec valeur P).

Pour examiner si le GABA peut être libéré par des activités présynaptiques à grande échelle, nous avons stimulé les neurones avec une électrode de champ et mesuré les PSC évoquées. Une fois de plus, l'application aiguë de CNQX a détecté la présence de composants IPSC évoqués proéminents, avec un coefficient de variation (CV) équivalent à celui des EPSC évoqués, qui pourraient ensuite être abolis par le traitement PTX (Fig. 2i). De plus, lorsqu'ils sont activés par un train de stimulations à haute fréquence ou de paires d'impulsions répétitives, ces IPSC évoqués présentent une plasticité classique à court terme avec une forte dépression synaptique, comme cela a également été observé pour les EPSC évoqués (Fig. 2j). Par conséquent, les présynapses GABAergiques non canoniques induites par V57 ont acquis des propriétés de libération comparables aux présynapses glutamatergiques normalement produites par les neurones Ngn2, probablement en raison du partage de mécanismes de libération communs.

Nous avons demandé si les facteurs V57 permettaient la formation de nouvelles structures synaptiques dans les cellules Ngn2 ou remodelaient les synapses glutamatergiques potentielles en un destin GABAergique. Pour tester cela, nous avons immunocoloré les cellules avec des anticorps présynaptiques spécifiques (Fig. S3a, b supplémentaires). Nous n'avons détecté aucun défaut de densité cellulaire ou de croissance globale des neurites (Fig. Supplémentaire S4a – c). La transduction V57 n'a pas modifié le nombre ou la morphologie des synapses totales marquées par l'anticorps Synapsin et n'a provoqué qu'une augmentation mineure de la taille des présynapses excitatrices positives pour vGLUT sans modifier leur densité (Fig. 3a, b). Cependant, les facteurs vGAT et GAD65/67 surexprimés sont principalement organisés en clusters, augmentant considérablement la taille et le nombre de présynapses GABAergiques, comme en témoigne leur distribution élaborée le long des dendrites, qui était pratiquement absente dans les neurones Ngn2 uniquement (Fig. 3c, d) .

a Exemples d'images (à gauche) de neurones Ngn2 uniquement contre NV57 immunocolorés avec le marqueur pan-synaptique Synapsin. Valeurs moyennes (à droite) de la densité de Synapsin puncta normalisées par la zone dendritique MAP2 et la taille de puncta. b–d Immunomarquages similaires à a, à l'exception du marqueur de présynapse glutamatergique vGLUT b et des marqueurs de présynapse GABAergique GAD65/GAD67 c ou vGAT d. e Images représentatives des branches dendritiques marquées à l'EGFP de Ctrl (Ngn2 uniquement, rangée du haut) par rapport aux neurones V57 (rangée du bas) co-marqués pour vGLUT et vGAT (pointes de flèche jaune et cyan, respectivement) ; Les projections z d'intensité maximale mettent en évidence une distribution complexe des deux types de synapses, en particulier dans l'état V57. f L'image en super-résolution (à gauche) d'une seule section optique de la condition V57 représente une co-localisation minimale entre les signaux vGLUT et vGAT ; les pointes de flèches grises pointent vers des signaux qui se chevauchent partiellement (réticule cyan) résolus sur l'axe x/z ou y/z ; Le profil d'intensité montre la séparation des pics entre les signaux d'une région d'intérêt (ligne pointillée jaune). Les coefficients de Mander (à droite) de co-localisation entre vGLUT et vGAT ont été tracés. g, h Identique à a, mais pour les marqueurs postsynapsiques glutamatergiques (Homer, g) ou GABAergiques (Gephyrin, h). i Identique à e, sauf pour la coexistence d'Homère élaboré et de Gephyrin puncta, en particulier dans l'état V57. j Identique à f, mais pour Homer post-synaptique et Gephyrin puncta qui illustrent de la même manière une co-localisation minimale. Les valeurs moyennes sur les graphiques à barres représentent les moyennes ± SEM pour le nombre de champs de vision analysés/lots indépendants. Les points de données individuels sont fournis sous forme de cercles ouverts codés par couleur. La signification statistique a été pondérée par le test t de Student bilatéral, non apparié (pour les valeurs d'asymétrie et d'aplatissement -2 > ≈ et ≈ < 2), ou par le test U bilatéral non paramétrique de Mann-Whitney (données sources), avec * **P < 0,005 ; **P < 0,01 ; *P < 0,05 ; ns = non significatif, P > 0,05.

En particulier dans les cellules V57, le co-marquage avec les anticorps vGLUT et vGAT a démontré une coexistence complexe des deux points lacrymaux, qui semblaient parfois se chevaucher dans des images projetées en z épaisses (Fig. 3e). Pour explorer si des synapses d'identités différentes peuvent se former dans les mêmes régions présynaptiques, nous avons utilisé la microscopie à super-résolution. Nous avons constaté que la plupart des points ponctuels co-positifs incluaient des signaux vGLUT contre vGAT qui provenaient principalement de différents plans focaux et pouvaient être résolus davantage dans les dimensions x / z ou y / z (Fig. S5a supplémentaire). Une analyse plus approfondie des sections optiques simples plus minces a suggéré que la majorité des points synaptiques dans l'état V57 comprenaient des signaux vGLUT ou vGAT, et non les deux (Fig. 3f). Par conséquent, les présynapses glutamatergiques et GABAergiques produisaient principalement des sites de libération séparés dans l'espace.

Pour évaluer plus en détail les effets sur l'organisation postsynaptique, nous avons surveillé les distributions des marqueurs postsynapses glutamatergiques et GABAergiques, par exemple Homer et Gephyrin (Fig. S3a, b supplémentaires). Nous avons remarqué que la co-transduction V57 diminuait respectivement augmentait le nombre de points ponctuels positifs à Homer vs Gephyrin sans affecter leurs tailles, à la fois dans les segments dendritiques ainsi que dans les régions périsomatiques des cellules Ngn2 (Fig. 3g, h et Figure supplémentaire S6a). Les neurones NV57 présentaient également des appositions substantielles entre la géphyrine post-synaptique et les amas de GABAAR à la surface cellulaire avec vGAT présynaptique et GAD65/67 puncta (Fig. S6b – d supplémentaire). Malgré ces réarrangements dans les spécifications synaptiques avec une élévation significative des caractéristiques GABAergiques (Fig. 3i), la condition V57 a continué à montrer une co-localisation limitée entre les amas d'Homère et de Gephyrin, qui présentaient des formes distinctes et occupaient des positions physiques différentes (Fig. 3j et Supplémentaire Figure S5b). Ces résultats impliquaient que la libération de GABA induite par V57 à partir des terminaisons présynaptiques peut probablement améliorer l'accumulation post-synaptique de Gephyrin et de GABAAR, qui étaient déjà exprimées dans les neurones Ngn2 uniquement. Néanmoins, ces synapses GABAergiques s'assemblent séparément, c'est-à-dire physiquement isolées, de leurs homologues glutamatergiques.

Pour évaluer à quel moment ces synapses induites acquièrent une identité morphologique et développent des propriétés fonctionnelles, nous avons analysé les neurones NV57 à différents moments du développement (Fig. 4a). Au cours des jours 15 à 60 après l'induction, les cellules ont mûri progressivement avec une augmentation constante de la capacité membranaire (Cm), une réduction de la résistance d'entrée (Rm) et une augmentation de la formation globale des synapses, comme le montre l'immunomarquage Synapsin (Fig. 4b, c) . Ensuite, pour surveiller la cinétique de maturation relative des synapses glutamatergiques vs GABAergiques, nous avons effectué des enregistrements patch-clamp. Nous avons remarqué que les fréquences et les amplitudes des sEPSC médiés par AMPAR et des sIPSC médiés par GABAAR augmentaient périodiquement au cours de cette période (Fig. 4d, e). Des cinétiques de maturation similaires ont également été observées pour l'EPSC et l'IPSC évoqués, en termes de force et de taux de réussite (Fig. 4f, g). En accord, l'immunomarquage avec les anticorps vGLUT et vGAT a également révélé que les synapses glutamatergiques et GABAergiques commencent à se former dès le jour 15 et continuent d'augmenter au jour 30, car leur densité et leur taille ont tendance à saturer vers le jour 45-60 (Fig. 4h, je). De plus, au jour 60, les clusters vGLUT contre vGAT ainsi que les clusters Homer contre Gephyrin n'occupaient individuellement qu'une fraction du total des signaux de synapsine, soutenant à nouveau l'idée que les synapses d'identités différentes sont pour la plupart séparées (Fig. 4j, k). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les synapses GABAergiques induites par V57 mûrissent en même temps que les synapses glutamatergiques, mais se stabilisent indépendamment les unes des autres.

a Protocole expérimental pour b–k ; Des neurones humains induits par Ngn2 ont en outre été infectés par des virus exprimant des facteurs V57 et analysés tous les 15 jours à partir du jour 15 après l'induction jusqu'au jour 60. b Graphiques récapitulatifs des valeurs Cm (gauche) et Rm (droite), à différents moments de la maturation neuronale. c Exemples d'images (à gauche) et de densité ou de taille moyenne (à droite) de Synapsin puncta constituée sur des neurites positifs pour Tuj1, mesurée à partir de neurones NV57 à différents stades de leur développement in vitro (voir annoté). d, e Traces d'échantillons (à gauche) et paramètres moyens (à droite, fréquence ou amplitude de l'événement) des sEPSC médiés par AMPAR d et GABAAR sIPSC e enregistrés en présence de PTX et de CNQX, respectivement, au jour 15–60. f, g EPSC évoqués par stimulation (f, avec PTX) et IPSC (g, avec CNQX) enregistrés aux moments indiqués ; exemples de traces (à gauche), d'amplitudes moyennes (au milieu) et de pourcentage de cellules avec des réponses détectables (à droite). h, i Identique à c, sauf pour vGLUT (h) ou vGAT (i) puncta formés sur des branches dendritiques MAP2-positives. J. Images représentatives (à gauche) et coefficients de Mander (à droite) de co-localisation entre Synapsin puncta et les signaux vGLUT ou vGAT. Les neurites ont été visualisés par co-expression d'EGFP soluble. Les signaux vGLUT et vGAT n'occupent individuellement qu'une fraction des synapses totales positives à la synapsine au jour 60. k Identique à j, sauf pour la co-localisation entre la synapsine et Homer ou Gephyrin, au jour 60. Toutes les données représentent des moyennes ± SEM. Les graphiques récapitulatifs indiquent également le nombre total de champs de vision analysés (pour l'immunomarquage) ou de neurones patchés (pour l'électrophysiologie)/lots indépendants, et les points de données individuels (cercles ouverts). La signification statistique des données normalement distribuées (valeurs d'asymétrie et d'aplatissement entre -2 et 2) dans les panels j et k a été calculée par un test t de Student bilatéral, non apparié, avec *** P < 0,005 ; **P < 0,01. Pour toutes les comparaisons par groupe (évolution dans le temps, b–i), une ANOVA unidirectionnelle a été effectuée et les valeurs P ont été indiquées.

La production de synapses GABAergiques progressant parallèlement à leur maturation fonctionnelle, nous nous sommes demandé si l'activation GABA-dépendante de GABAAR ou de GABABR pouvait favoriser la formation et/ou la stabilité à long terme de ces synapses induites. Pour sonder cela, nous avons effectué des traitements chroniques avec l'antagoniste du GABAAR PTX ou l'antagoniste du GABABR CGP55845, échangé à moitié le milieu avec des médicaments tous les deux jours à partir du jour 4 à 5 et analysé les cellules du jour 56 au jour 60 (Fig. 5a) . Nous avons constaté que l'application de PTX, mais pas de CGP, réduisait considérablement le nombre de vGAT et de Gephyrin puncta sans affecter leur taille (Fig. 5b, c). Le traitement chronique par PTX n'a pas altéré la survie neuronale ni leur arborisation dendritique, mais a diminué l'apposition entre les signaux vGAT et Gephyrin (Fig. S7a – c supplémentaires), indiquant des défauts spécifiques de la morphologie des synapses GABAergiques.

a Stratégie expérimentale pour les panels b–f ; Les neurones NV57 ont été incubés avec des inhibiteurs synaptiques, des milieux à moitié échangés tous les deux jours du jour 4-5 post-induction au jour 56-60, puis analysés comme indiqué (flèche). b, c Exemples d'images (à gauche) et densité ou taille normalisée (à droite) des amas vGAT b et Gephyrin c formés sur des dendrites MAP2-positives, lorsqu'ils sont traités avec du DMSO uniquement (contrôle), 100 µM PTX ou 10 µM CGP55845. d Formes d'onde mIPSC représentatives (en haut) et fréquence ou amplitude d'événement (en bas) tracées sous forme de distribution cumulative (à gauche) avec des graphiques récapitulatifs (à droite), pour les neurones témoins par rapport aux neurones traités au PTX (à long terme). Les cultures ont été soigneusement lavées avec une solution de bain avant les enregistrements électrophysiologiques ; CNQX a été utilisé pour arrêter les EPSC. e Exemple de traces (en haut) de courants GABAAR produits par 1 mM de bouffée de GABA et de transfert de charge total (en bas). f Exemples d'images (à gauche) de neurones témoins par rapport aux neurones traités au PTX (têtes de flèches), immunocolorés pour les épitopes extracellulaires des GABAAR de surface et de la MAP2 dendritique. Les régions encadrées sont agrandies (encarts recadrés, en haut à droite), la densité normalisée et les tailles des grappes GABAAR sont tracées (en bas à droite), pour le contrôle par rapport au traitement PTX. Toutes les données récapitulatives sont des moyennes ± SEM, avec le nombre total de cellules enregistrées (électrophysiologie) ou le champ de vision analysé (imagerie) / lots indépendants, et les points de données individuels ont été inclus sous forme de cercles ouverts. Une distribution proche de la normale a été prédite pour la plupart des ensembles de données, sur la base des valeurs d'asymétrie ou d'aplatissement (-2 >≈ et ≈ < 2). Par conséquent, la signification statistique a été principalement évaluée par un test t de Student bilatéral, non apparié, avec *** P < 0,005 ; *P < 0,05 ; ns = non significatif, P > 0,05. Plusieurs groupes (b et c) ont été comparés par le test de Kruskal-Wallis associé au test U post-hoc non paramétrique de Mann-Whitney, et les valeurs P correspondantes ont été rapportées.

Pour évaluer davantage les effets sur les propriétés fonctionnelles des synapses GABAergiques, nous avons examiné la localisation de surface et synaptique des GABAAR. Nous avons lavé le PTX et exécuté des enregistrements à voltage imposé dans des médias sans médicament. Conformément à la réduction du nombre de synapses GABAergiques, les neurones traités au PTX ont illustré un déficit significatif de la fréquence mIPSC sans modifier leur amplitude, leur cinétique d'événement ou leurs propriétés intrinsèques de la membrane cellulaire (Fig. 5d et Supplémentaire Fig. S7d, e). Pour évaluer si ce phénotype était dû à un trafic de surface inférieur des GABAAR, nous avons appliqué du GABA exogène par pression-perfusion, mais nous n'avons pas remarqué d'effets substantiels sur le transfert de charge du GABAAR, ce qui implique un niveau similaire de récepteurs à la surface de la cellule (Fig. .5e). Cependant, le traitement à long terme par PTX a diminué la densité des amas dendritiques de GABAAR sans affecter leur taille (Fig. 5f). Ainsi, l'activation persistante des GABAAR mais pas des GABABR régule les propriétés de développement et/ou le maintien des synapses GABAergiques induites par V57.

Nous avons ensuite demandé si les phénotypes GABAergiques médiés par V57 pouvaient être reproduits lorsque les neurones humains sont différenciés des cellules souches autres que les cellules H1-ES. Pour tester cette idée, nous avons tiré parti d'une lignée de cellules souches pluripotentes induites isogéniques (iPS) qui exprimait de manière stable le transgène Ngn2 lors de l'induction de la doxycycline et générait des neurones humains à haute efficacité, qui étaient essentiellement glutamatergiques et manquaient également d'expression endogène de vGAT et de GAD65/6733 . Immédiatement après l'induction neurale, nous les avons infectés avec des virus V57, co-cultivés avec de la glie, et les avons caractérisés entre 35 et 42 jours lorsqu'ils ont atteint une morphologie étendue (Fig. 6a et Fig. S8a supplémentaire). La population a montré des quantités considérables de transduction d'ARNm de vGAT, GAD65 et GAD67 et de localisation de protéines le long de leurs arbres dendritiques élaborés (Fig. 6b, c et Fig. S8b – d supplémentaire). Ces structures synaptiques enrichies en vGAT ont également recruté des SAM post-synaptiques GABAergiques majeures, par exemple Neuroligin-2 (Fig. S8e supplémentaire) 12,34,35.

a Images en contraste de phase de cellules iPS (ligne WTC-11, à gauche) et de neurones humains différenciés (jour 42, à droite). b, c RT-PCR quantitative (qRT-PCR, b) et immunomarquages c contre les transgènes vGAT ou GAD65/67 dans des neurones dérivés de cellules iPS, co-marqués pour MAP2 dendritique, DAPI nucléaire et un antigène nucléaire humain HuNu. d Exemple d'image de super-résolution à partir d'un seul plan confocal (à gauche) et les valeurs de coefficient de Mander (% de surface, à droite) confirment une co-localisation minimale entre vGLUT et vGAT puncta (flèches jaunes et cyan, respectivement). e Exemple de tracés (à gauche) et de relations courant-tension (courbes IV ; amplitudes de crête à Vhold = -80 à +20 mV, avec des incréments progressifs de 10 mV, à droite) d'IPSC déclenchés par des bouffées de GABA 1 mM (flèches) sur cellule iPS- neurones dérivés, en conditions contrôle et V57. Les données moyennes sont ajustées à l'aide de lignes droites (équation : y = a + bx) ; a = 32,5 ± 10 pA, b = 22,33 ± 1,22 pA pour les neurones témoins, et a = 29,64 ± 18 pA, b = 27,89 ± 2,7 pA pour la condition V57. f, g Traces représentatives f et fréquences d'événements g de sPSC enregistrées à Vhold = -70 mV ou +10 mV, en présence de PTX ou CNQX + CPP, en condition de contrôle (en haut) par rapport à V57 (en bas), comme indiqué. Les marques fractionnées entre les traces concatènent les enregistrements continus des mêmes neurones ; sEPSC (flèches bleues) ou sIPSC (flèches rouges). h Exemple de traces (à gauche) et d'amplitudes moyennes de mIPSC insensibles au TTX (à droite) enregistrées à Vhold = -70 mV ou +10 mV, en présence de CNQX + CPP, à partir de neurones dérivés de cellules iPS transduits avec des facteurs V57. je. IPSC évoqués générés par une stimulation répétitive à haute fréquence en condition V57 ; traces superposées (à gauche) avec une libération synchrone fiable et une composante de libération retardée proéminente (en médaillon, pointes de flèches avec boîte en pointillé agrandie) après la fin du train de stimulation (série de flèches) ; amplitudes IPSC moyennes et dépression à court terme à différents Vhold, comme indiqué (à droite). Les valeurs moyennes sont fournies sous forme de moyennes ± SEM, avec le nombre total de cellules enregistrées (pour l'électrophysiologie) ou le champ de vision analysé (imagerie)/lots indépendants, ou uniquement le nombre de lots (b). Tous les points de données couplés expérimentalement sont fournis sous forme de cercles ouverts de couleur assortie avec des lignes connectées. Les distributions de données étaient approximativement normales (données source), pour les valeurs d'asymétrie et d'aplatissement -2 > ≈ et ≈ < 2. La signification statistique a été évaluée par un test t de Student bilatéral, apparié, avec *** P < 0,005 ; *P < 0,05 ; ND = événements non détectés.

Semblable aux neurones dérivés des cellules H1-ES, les co-immunomarquages pour vGLUT vs vGAT ou Homer vs Gephyrin dans ces neurones dérivés de cellules iPS ont également révélé très peu de co-localisations entre deux types de synapses différents, suggérant à nouveau que glutamatergique vs GABAergique les spécifications occupent des zones pré- et post-synaptiques mutuellement exclusives (Fig. 6d et Supplémentaire Fig. S8f, g). Les bouffées de GABA exogènes ont démontré des IPSC internes importants à Vhold ≈ -70 mV qui se sont inversés autour de ≈ 0 mV, confirmant à nouveau la présence de GABAAR de surface également dans les neurones dérivés de cellules iPS sans ou avec co-expression de V57 (Fig. 6e). Dans des enregistrements continus des mêmes neurones dans la condition de contrôle, les traitements avec CNQX avec le bloqueur des récepteurs NMDA (NMDAR) acide 3-carboxypipérazine-propyl phosphonique (CPP) ont fait taire la majorité des courants synaptiques quel que soit le Vhold, corroborant leur identité glutamatergique pure (Fig. 6f, g). Dans les cellules V57, l'application successive de PTX et de CNQX + CPP a respectivement inhibé les sIPSC et les sEPSC, attestant de la coexistence des synapses glutamatergiques et GABAergiques (Fig. 6f, g). De plus, en maintenant les neurones V57 à -70 mV, mais pas à +10 mV (c'est-à-dire proche du potentiel d'inversion Cl estimé, ECl ≈ +14 mV, dans une configuration de cellule entière sans tenir compte du potentiel de jonction), dépeint des mIPSC authentiques même en présence de TTX, ainsi que des IPSC évoqués fiables déclenchés avec une libération retardée robuste et une plasticité à court terme prononcée (Fig. 6h, i). Par conséquent, notre approche était hautement reproductible pour générer des synapses GABAergiques humaines pleinement opérationnelles in vitro, indépendamment des lignées de cellules souches reprogrammées.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si les facteurs V57 peuvent produire des synapses GABAergiques fonctionnelles également chez les animaux vivants. Pour cette expérience de preuve de principe, nous avions l'intention d'utiliser une synapse glutamatergique modèle basée sur deux critères de sélection : (i) le site d'injection virale (c'est-à-dire les corps cellulaires des neurones présynaptiques) est physiquement éloigné du site d'enregistrement (c'est-à-dire corps cellulaires des neurones postsynaptiques), et (ii) le neurone postsynaptique reçoit des apports GABAergiques négligeables provenant d'autres sources. Ces contraintes étaient nécessaires pour garantir que la transduction virale des facteurs V57 cible principalement le neurone présynaptique glutamatergique souhaité, sans potentialiser indirectement les entrées GABAergiques locales vers la cellule postsynaptique.

À cette fin, nous avons injecté des particules virales dans le ganglion spiral de la souris, ce qui donne naissance à des fibres du nerf auditif (NA) qui projettent des sorties purement glutamatergiques (également appelées «bulbe de Held») principalement sur les corps cellulaires des cellules touffues (BCs ), situé à distance dans le noyau cochléaire (Fig. 7a)36,37. Nous avons effectué des injections lentivirales de facteurs V57 au jour 2–4 postnatal (P2–4), préparé des tranches de cerveau et les avons analysées sur P18–32, c'est-à-dire lorsqu'un virus témoin codant RFP a montré une transduction substantielle au site d'injection (Fig. S9a supplémentaire , b). Les BC manquent d'entrée GABAergique bien définie et reçoivent principalement soit des bulbes terminaux glutamatergiques positifs à la calrétinine d'environ 4 à 5 fibres AN, soit des terminaux glycinergiques positifs au vGAT d'interneurones locaux, qui forment des synapses physiquement séparées les unes des autres (Fig. 7b) 38 ,39,40,41. Cependant, les animaux transduits avec des facteurs V57 ont démontré une augmentation importante de la co-localisation entre les signaux de la calrétinine et du vGAT, indiquant une induction réussie de transgènes dans les terminaisons de la fibre AN (Fig. 7b, c). Il convient de noter que l'efficacité de transduction in vivo du lentivirus était relativement faible par rapport à notre approche in vitro (voir Fig. 3c, d) et n'a pas modifié de manière significative la taille de l'ampoule (Fig. 7b, c).

un diagramme schématique décrit la stratégie expérimentale pour manipuler l'identité de l'émetteur de la synapse de l'ampoule. b Images représentatives de somas BC (cercles cyan) entourés de terminaux présynaptiques positifs à la calrétinine et au vGAT, chez les animaux témoins (à gauche) par rapport aux animaux ayant reçu une injection de V57 (à droite). Les signaux vGAT se chevauchaient souvent avec les terminaux de bulbe positifs à la calrétinine dans l'état V57 (flèches jaunes), mais de manière minimale pour l'état de contrôle (flèches blanches). c Taille moyenne des terminaux AN mesurée à l'aide des signaux de la calrétinine (à gauche), de la zone des bulbes co-occupés par le signal vGAT (au milieu) et de la fraction des bulbes co-exprimant vGAT (à droite), vraisemblablement induite par les facteurs V57. d, e Traces d'échantillons d et distribution de fréquence des décroissances τ e des sEPSC (pointes de flèche bleues et histogramme) et des sIPSC (pointes de flèche rouges et histogramme) enregistrées à partir des conditions de contrôle (à gauche) par rapport à V57 (à droite). Encarts dans e, échantillons de traces sEPSC et sIPSC mises à l'échelle et superposées pour comparer leur cinétique d'événement. Tous les enregistrements ont été effectués en présence de 1 µM de strychnine pour supprimer les sIPSC des apports glycinergiques locaux. f, g Diagrammes de probabilité cumulée et graphiques à barres moyens de la fréquence des événements (à gauche) et des amplitudes (à droite), pour les sEPSC médiés par AMPAR f ou les sIPSC médiés par GABAAR g. h Exemple de traces de CSP évoquées (artefacts de stimulation remplacés par des flèches grises), enregistrées à partir de l'état témoin (à gauche) par rapport à V57 (à droite), après un traitement aigu de 1 µM de strychnine (traces bleues) ou suite à l'ajout de 10 µM de NBQX + 5 µM CPP (traces rouges) et 20 µM Bicuculline (traces noires). Pointes de flèches, EPSC (bleu) ou IPSC (rouge). i Les diagrammes circulaires représentent la fraction de cellules avec les types de PSC indiqués (soit EPSC uniquement, soit IPSC uniquement, soit les deux). j Amplitudes des EPSC évoqués (à gauche) et des IPSC (à droite), moyennées à partir des neurones avec des réponses réussies. Les moyennes indiquent la moyenne ± SEM, avec le nombre total de champs de vision analysés (pour l'imagerie) ou les neurones patchés (pour l'enregistrement patch-clamp) / nombre d'animaux injectés, et les points de données individuels (cercles ouverts à code couleur). La signification statistique a été testée par un test t de Student bilatéral, non apparié (résultats presque normalement distribués) ou par un test U de Mann-Whitney bilatéral non paramétrique, avec *** P < 0,005 ; **P < 0,01 ; *P < 0,05 ; ns = non significatif, P > 0,05.

Pour déterminer si les expressions ectopiques de V57 dans des bulbes terminaux autrement glutamatergiques peuvent déclencher la formation de synapses GABAergiques fonctionnelles, nous avons effectué des enregistrements de voltage-clamp à partir de BC postsynaptiques en présence de strychnine qui inhibe préférentiellement les récepteurs de la glycine (GlyR) par rapport aux GABAAR. En condition de contrôle, les BC présentaient principalement des sEPSC avec des désintégrations τ rapides, tandis que l'induction V57 provoquait une forte augmentation des sIPSC avec des désintégrations τ plus lentes (Fig. 7d, e). La transduction en mosaïque médiée par les lentivirus des facteurs V57 n'a modifié ni l'amplitude ni la fréquence des sEPSC, mais a considérablement augmenté la fréquence des sIPSC sans affecter l'amplitude des sIPSC (Fig. 7f, g).

Enfin, nous avons inspecté les PSC des BC évoqués par la stimulation AN présynaptique. Chez les animaux témoins, les CSP évoquées insensibles à la strychnine ont montré une cinétique de désintégration rapide et ont été largement bloquées par un traitement aigu de l'antagoniste AMPAR NBQX (Fig. 7h, i). Cependant, les animaux transduits par les facteurs V57 présentaient souvent la co-présence d'un composant IPSC plus lent qui ne pouvait être inhibé que par le bloqueur GABAAR Bicuculline (Fig. 7h, i). Plusieurs BC dans la condition V57 ont également manifesté des IPSC principalement évoqués sans aucun EPSC détectable, un phénomène qui n'a jamais été observé dans la condition de contrôle (Fig. 7i). En moyenne à partir des BC uniquement avec une réponse mesurable, l'induction V57 a augmenté de manière significative l'amplitude des IPSC évoqués sans altérer les EPSC (Fig. 7j). Ainsi, les facteurs V57 peuvent déclencher avec succès la formation de synapses GABAergiques fonctionnelles également dans un système in vivo.

Le système nerveux central des mammifères contient différents types de synapses qui libèrent et détectent une variété de neurotransmetteurs. La capacité de synthétiser et de transmettre ces produits chimiques distincts nécessite souvent des ensembles d'enzymes mutuellement exclusifs ainsi que des transporteurs vésiculaires qui sont exprimés de manière endogène dans certaines lignées neuronales. Une fois les destins neuronaux établis au début du développement, le type de transmetteur produit par un neurone présynaptique est considéré comme stable et irréversible. Étant donné que l'identité du transmetteur est une caractéristique inhérente de sous-types neuronaux spécifiques, toutes les connexions synaptiques formées entre une paire donnée de neurones sont généralement homotypiques, par exemple, soit glutamatergiques, soit GABAergiques, qui ne changent généralement pas avec le temps42,43.

Nous avons illustré ici que l'expression ectopique de vGAT + GAD65 + GAD67 peut attribuer une identité GABAergique robuste sur des neurones humains et murins exclusivement glutamatergiques. Cette libération présynaptique de GABA a été capable d'activer les GABAAR post-synaptiques et a produit des synapses GABAergiques entièrement fonctionnelles qui manifestaient des IPSC miniatures authentiques et dépendantes de l'AP avec une plasticité à court terme prononcée (Figs. 1 et 2). Ces phénotypes GABAergiques étaient hautement reproductibles dans plusieurs lignées cellulaires, à la fois pour les systèmes in vitro et in vivo (Figs. 6 et 7). La reprogrammation directe du type d'émetteur n'a pas modifié le nombre total de synapses, mais a provoqué un réarrangement dans les structures pré/post-synaptiques (Fig. 3). Les synapses GABAergiques induites se sont formées indépendamment des synapses glutamatergiques voisines, mais ont présenté une cinétique de maturation similaire et étaient partiellement dépendantes de l'activité GABAAR (Figs. 4 et 5). En somme, notre approche a institué une voie facile pour induire des synapses fonctionnelles par synthèse de novo de transmetteur (Fig. S10a supplémentaire).

Nos résultats sont entièrement cohérents avec un rapport précédent indiquant que la capacité à libérer du glutamate par rapport au GABA par différents sous-types neuronaux pourrait dépendre principalement de leur expression différentielle d'enzymes spécifiques au transmetteur et de transporteurs vésiculaires44. Une fois produites, les vésicules contenant différents émetteurs peuvent ne pas nécessairement nécessiter de machines de libération spécialisées uniques aux différents types de synapses. Conformément à cette théorie, des études antérieures ont également décrit la co-transmission de différents produits chimiques à partir des mêmes neurones, et parfois même à partir des mêmes terminaux présynaptiques avec des sites de libération spatialement séparés mais morphologiquement similaires21,23,45,46,47,48,49 .

Fait intéressant, bien que les neurones exprimant V57 aient synthétisé à la fois le glutamate et le GABA, ils ont produit des événements mEPSC et mIPSC mutuellement exclusifs avec une cinétique distincte. Ceux-ci pourraient à leur tour être inhibés individuellement par des bloqueurs sélectifs des récepteurs sans atténuer la fréquence des autres types d'événements (Figs. 1, 2, 6 et 7). Ces résultats impliquent que le glutamate et le GABA sont co-transmis mais probablement pas co-libérés simultanément pour co-activer leurs récepteurs correspondants. De plus, les marqueurs pré- et post-synaptiques marquant les synapses glutamatergiques et GABAergiques ont également manifesté une co-localisation limitée (Fig. 3 et 6, et Fig. Supplémentaires. S5, S8f, g), indiquant qu'ils sont physiquement séparés (Fig. Supplémentaire S10b) . Encore une fois, un phénomène similaire a été observé in vivo pour différents co-transmetteurs, qui se trouvent souvent distribués dans des vésicules synaptiques séparées et libérés indépendamment45,47,50.

Comment la libération présynaptique de GABA facilite-t-elle la création de synapses fonctionnelles ? Des découvertes récentes suggèrent que l'activation des GABAAR peut jouer un rôle essentiel dans cette voie, car il a été démontré que la suppression génétique des sous-unités GABAAR ou l'inhibition pharmacologique avec des antagonistes spécifiques altère la formation des synapses GABAergiques20,27. Bien qu'en accord avec cette notion, l'exposition à long terme à la PTX a également réduit la densité des synapses GABA-ergiques induites par V57, mais elle n'a pas réussi à les éliminer complètement (Fig. 5). De plus, bien que les facteurs V57 aient élevé la densité des postsynapses GABAergiques, un niveau substantiel de grappes de géphyrine et de GABAAR était déjà présent même dans les neurones Ngn2 uniquement, dépourvus de toute libération présynaptique de GABA. Par conséquent, des mécanismes cellulaires supplémentaires pourraient également contribuer au développement des synapses GABAergiques. Par exemple, les GABAAR interagissent directement avec les neurexines présynaptiques et peuvent également potentiellement s'assembler en complexes moléculaires avec les neuroligines postsynaptiques, la géphyrine et/ou la collybistine pour établir un alignement pré- et post-synaptique avec ou sans libération de GABA. Alternativement, les molécules de GABA peuvent se lier à des éléments trans-synaptiques encore inconnus pour activer la synaptogenèse inhibitrice. Il convient de noter que, comme pour les synapses GABAergiques, l'activation des récepteurs de la glycine (GlyR) peut également favoriser leur regroupement synaptique dans les neurones spinaux, qui pourrait être médié par des voies de signalisation cellulaire communes en aval de l'activation des récepteurs53.

Auparavant, il a été démontré que les perturbations des mécanismes de libération présynaptiques n'avaient que des effets mineurs ou nuls sur la synaptogenèse, ainsi que sur la formation des épines dendritiques et leur maintenance54,55,56,57. Il convient de reconnaître que, bien que ces approches génétiques élégantes aient éliminé la grande majorité des activités synaptiques, il reste plausible qu'un niveau minimal de signal d'émetteur basal, par exemple une libération spontanée résiduelle, soit suffisant pour instituer l'identité des synapses. Même en l'absence de libération neuronale, la sécrétion diffuse du transmetteur par les cellules locales de l'astroglie peut également déclencher l'activation des récepteurs synaptiques58. Alternativement, les protéines présynaptiques associées à la production enzymatique et/ou à l'emballage vésiculaire de différents neurotransmetteurs eux-mêmes pourraient interagir directement ou indirectement avec d'autres molécules synaptiques et participer aux processus synaptogènes, même en l'absence de libération de transmetteur actif. Les contributions de l'activation des récepteurs synaptiques dans la formation des synapses glutamatergiques restent également controversées. Bien qu'il ait été démontré que l'activation persistante des récepteurs ionotropes du glutamate facilitait l'excroissance de la colonne vertébrale59,60,61, l'élimination de toutes les sous-unités AMPAR et NMDAR n'a pas affecté la distribution des vésicules présynaptiques ou la morphologie postsynapse62. Par conséquent, plusieurs voies parallèles pourraient moduler le développement des synapses glutamatergiques, et ces mécanismes pourraient différer considérablement de la synaptogenèse GABAergique. Des études futures sont nécessaires pour étudier ces différentes possibilités.

En utilisant le glutamate et le GABA uncaging, des études antérieures ont rapporté que la libération aiguë de neurotransmetteurs elle-même peut faciliter la formation de synapses naissantes, de manière spatialement délimitée26,27. Ici, nous avons démontré que, dans le contexte physiologiquement pertinent de la libération vésiculaire présynaptique, ces synapses induites par le transmetteur peuvent atteindre une maturation morphologique et fonctionnelle beaucoup plus grande. Par rapport aux méthodes de photo-stimulation, les structures synaptiques GABAergiques induites par V57 ont atteint une croissance substantielle de leur densité et de leur taille, et ont affiché des IPSC fiables avec une reproductibilité élevée, ce qui les rend propices à une modification stable, efficace et étendue de l'identité des synapses. Notre protocole a également réussi à la fois dans le modèle in vitro de cultures neuronales humaines et dans le cerveau de souris in vivo, et pourrait donc potentiellement être adopté pour manipuler les circuits affectés par la toxicomanie ou les troubles mentaux.

En utilisant la différenciation cellulaire médiée par de petites molécules et le criblage des facteurs de transcription, nous et d'autres avons précédemment dérivé des neurones GABAergiques directement à partir de cellules ES63,64,65,66,67. Ces neurones différenciés ou reprogrammés expriment divers marqueurs et présentent des propriétés AP qui imitent les sous-types de neurones GABAergiques indigènes au cerveau humain. Bien que notre approche actuelle ne génère pas de lignées neuronales spécifiques, les synapses GABAergiques produites par les facteurs V57 manifestent de la même manière des IPSC miniatures et évoquées robustes avec une amplitude et une fréquence comparables, qui mûrissent avec le temps et peuvent être utilisées pour des essais in vitro. La transduction virale des enzymes GABAergiques offre également certains avantages par rapport aux neurones GABAergiques induits par les facteurs de transcription, notamment pour leurs applications in vivo. Lorsqu'ils sont transplantés dans le cerveau, les neurones reprogrammés luttent parfois contre la survie à long terme, le manque de maturation fonctionnelle, la migration restreinte et l'intégration synaptique limitée dans les circuits neuronaux préexistants63,64,65. La livraison virale des facteurs V57 peut contourner certains de ces problèmes techniques en formant de nouvelles synapses GABAergiques dans les populations neuronales déjà disponibles.

Toutes les méthodes de culture cellulaire ainsi que les procédures de production de lentivirus ont été approuvées par le Comité institutionnel de biosécurité (protocole IRB # 19-059B) de la Colorado State University. Toutes les expériences sur des souris (y compris mâles et femelles, souche JAX CBA/CaJ) ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (protocole IACUC # 201800101) de l'Université de Buffalo et menées conformément aux directives éthiques.

Des cellules ES humaines (lignée H1, catalogue # WA01) ont été achetées auprès du WiCell Research Institute dans le cadre d'un accord de transfert de matériel (MTA # 19-W0439). La lignée cellulaire iPS humaine (WTC-11) a été généreusement offerte par le Dr Michael E. Ward, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS). Les cellules 293T de rein embryonnaire humain (HEK) pour la production de virus étaient disponibles dans le commerce auprès de Takara Bio USA (catalogue # 632180).

Les constructions lentivirales utilisées pour la reprogrammation neuronale des cellules ES humaines comprenaient Ngn2-t2A-PuromycinResistance (promoteur Tet-on) et rtTA (promoteur Ubiquitin), avec un virus optionnel codant pour l'EGFP (promoteur Tet-on) pour les analyses morphologiques31. Les ADNc codant pour vGAT, GAD65 et GAD67 humains (facteurs V57) ont été clonés dans un vecteur lentiviral piloté par le promoteur Synapsin-1 humain (voir la Fig. S8b supplémentaire), suivi d'un élément régulateur de la marmotte (WRE), et flanqué de 5 'et Répétitions terminales longues de 3' (LTR).

Trois plasmides auxiliaires (c'est-à-dire pRSV-REV, pMDLg/pRRE et VSV-G ; 7 à 8 µg chacun) et les vecteurs d'expression correspondants (15 à 20 µg) ont été co-transfectés avec de la polyéthylènimine (PEI) dans 70 à 80 % de confluence Cellules HEK 293T (contenant l'antigène T SV40 pour faciliter la production de virus) étalées sur des boîtes de 10 cm. 8 à 10 h après la transfection, le milieu de culture a été complètement échangé et le surnageant contenant des particules de lentivirus a été collecté après 36 h et 60 h. Le surnageant a ensuite été regroupé et centrifugé à ~ 800 × g pendant 6 à 8 min pour éliminer tout débris de cellules HEK. Le surnageant a ensuite été centrifugé à ~ 120 000 × g pendant 2 h à 4 ° C (ultracentrifugeuse Beckman L8–70M équipée d'un rotor SW41Ti). Les culots viraux ont été remis en suspension dans environ 50 à 100 µl de milieu DMEM, stockés pendant une nuit à 4 ° C, puis aliquotés et congelés à -80 ° C avant utilisation expérimentale.

Les cellules H1-ES humaines (voir Fig. 1 à 5) et une lignée cellulaire iPS isogénique avec le transgène Ngn2 inductible par la doxycycline (WTC-11 ; voir Fig. 6)33 ont été maintenues dans un milieu mTeSR™1 / mTeSR™ Plus ( StemCell Technologies) dans des conditions sans alimentation. Les médias changeaient tous les jours. Lorsque la densité cellulaire a atteint environ 70 %, elles ont été dissociées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 0, 5 mM d'EDTA et étalées à une dilution de 1: 6 sur des puits recouverts de Matrigel (BD Bioscience). Pendant le passage, les cultures ont en outre été complétées avec l'inhibiteur ROCK Y-27632 (2, 5 μM, MedChem Express) pendant la nuit, mais exclues pour les changements de milieu ultérieurs.

Pour les cellules H1-ES, la conversion neuronale directe médiée par Ngn2 a été obtenue comme décrit précédemment31,32. En bref, des cellules ES ont été co-infectées avec des lentivirus codant pour rtTA et Ngn2-t2A-PuromycinResistance, induits avec de la doxycycline (2 μg/ml), sélectionnés avec de la puromycine (1 μg/ml), dissociés doucement avec du PBS + EDTA ou de l'accutase (Innovative Cell Technologies) et replaqué avec de la glie primaire de souris (passage 1–2, dérivé de souris CD-1 ® IGS) sur des lamelles enduites de Matrigel (voir Fig. 1a). Une stratégie similaire a été adoptée pour les neurones dérivés de cellules iPS, qui ont été directement reprogrammés par exposition à la doxycycline (voir Fig. S8a supplémentaire)33. Les neurones ont en outre été infectés par des lentivirus exprimant les facteurs V57 pendant ou immédiatement après la différenciation, comme illustré dans les délais du protocole, et un virus fabriqué à partir d'un vecteur pFSW-67 vide a été utilisé comme contrôle de l'infection.

Des jours 0 à 14, les neurones ont été cultivés dans des milieux N3 (DMEM/F12 [Thermo Fisher] + N2 [Thermo Fisher] + B27 [Thermo Fisher]), supplémentés en insuline [20 μg/ml, Sigma], pénicilline/streptomycine [ Thermo Fisher]). Au cours de la co-culture gliale, 2 à 2,5 % de sérum bovin fœtal (FBS, Atlas Biologicals) ont été inclus. Le milieu a été échangé à moitié tous les 3 à 4 jours et additionné de 5-fluorodésoxyuridine (FdU, 10 µM) pour inhiber la croissance gliale après avoir atteint 70 à 80 % de confluence. A partir du jour 15, le milieu N3 a été progressivement remplacé par le milieu Neurobasal Plus [Thermo Fisher] + B27 + pénicilline/streptomycine, également supplémenté en FBS + FdU.

Des enregistrements patch-clamp de cellules entières de neurones humains ont été effectués de manière similaire à celle décrite précédemment67,68. En bref, les neurones ont été patchés à l'aide d'une solution interne contenant (pour voltage-clamp, en mM) 135 CsCl2, 1 EGTA, 1 NaGTP, 2 QX-314 et 10 HEPES-CsOH (pH 7,4, 310 mOsm) ; ou (pour pince de courant, en mM) 130 KCl, 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,5 EGTA, 0,16 CaCl2, 4 Na2ATP, 0,4 NaGTP, 14 Tris-créatine phosphate et 10 HEPES-KOH (pH 7,3, 310 mOsm). La solution de bain extracellulaire contenait (en mM) 140 NaCl, 5 KCl, 3 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glucose et 10 HEPES-NaOH (pH 7,4, 300 mOsm). Tous les enregistrements ont été effectués à température ambiante, à l'aide d'un amplificateur patch-clamp intégré (IPA, Sutter Instruments) contrôlé par un système d'acquisition de données personnalisé Igor Pro 8 (WaveMetrics). Pour toutes les cellules, la qualité du patch a été contrôlée à l'aide de valeurs de résistance en série (Rs < 15 MOhm), qui n'ont pas changé de manière significative entre les groupes expérimentaux. Les enregistrements de voltage-clamp pour les EPSC AMPAR et les IPSC GABAAR ont été effectués à un Vhold de -70 mV, sauf indication contraire (Fig. 6). Les CSP évoquées ont été déclenchées par des stimulations de champ à l'aide d'une électrode matricielle (FHC, MX21AEW-RT2) connectée à un stimulateur d'impulsions isolé A365RC (World Precision Instruments). Les PSC médiées par AMPAR ou GABAAR ont été isolées à l'aide de PTX (100 μM; bloqueur GABAAR / GlycineR, Tocris Bioscience) ou CNQX (25 μM; bloqueur AMPAR; Tocris Bioscience), respectivement. Bien que tous les enregistrements de voltage-clamp à Vhold = -70 mV contenaient du Mg2+ extracellulaire pour bloquer les NMDAR, certaines expériences à Vhold = +10 mV (voir Fig. 6) incluaient également du CPP (50 μM ; inhibiteur NMDAR ; Tocris Bioscience). La tétrodotoxine (TTX; 2 μM; Ascent Scientific) a été ajoutée à la solution externe pendant tous les enregistrements miniatures mEPSC et mIPSC, pour éviter la libération présynaptique causée par les AP spontanés. La perfusion sous pression de 1 mM AMPA (bromhydrate RS-AMPA, Tocris Bioscience) ou 1 mM GABA (Tocris Bioscience) a été réalisée pendant 100 ms, avec des bouffées de 20 psi à l'aide de Picospritzer III (Parker Instrumentation), et les transferts de charge totaux ont été calculés dans les 30 s de l'application de bouffée.

Pour la Fig. 5b – f, les cellules ont été incubées avec un antagoniste du GABAAR PTX (100 μM) ou un antagoniste du GABABR CGP55845 (10 μM, Tocris Bioscience) ou du DMSO (contrôle) immédiatement après le co-placage avec de la glie, le jour post-induction 4–5. Les milieux ont été échangés à moitié tous les deux jours avec des doses équivalentes de médicaments, et les cellules ont été analysées au jour 56-60 (Fig. 5a). Pour l'immunocoloration, les cultures ont été lavées 3 à 4 fois avec du PBS, fixées par du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à température ambiante et traitées pour l'incubation d'anticorps (voir ci-dessous). Pour le patch de cellules entières, les neurones ont été soigneusement lavés 3 × 2 min avec une solution de bain avant l'enregistrement.

La méthode d'injection lentivirale in vivo dans la fenêtre ronde de la souris a été adoptée à partir des protocoles précédents en utilisant des modifications mineures69,70. En bref, de petites incisions ont été faites à environ 1 cm caudale du pavillon de souris néonatales (P2-P4), et la bulle tympanique a été exposée pour révéler la fenêtre ronde en dessous (voir Fig. S9a supplémentaire). La bulle tympanique a été perforée avec une aiguille de calibre 34 et laissée s'écouler pendant au moins 10 min. Environ 0,3 µl de lentivirus (un cocktail de 0,1 µl de GAD65, 0,1 µl de GAD67 et 0,1 µl de vGAT) ou AAV-chrimson/RFP (contrôle) a été lentement injecté dans la fenêtre ronde à l'aide d'une seringue Hamilton de 5 µl avec un 34-gauge amovible aiguille, biseau de 0,375" 12°. Notez qu'un volume d'injection plus élevé pourrait entraîner un débordement de liquide, une perturbation de l'aqueduc cochléaire et une fuite dans le liquide céphalo-rachidien. Après avoir rétracté l'aiguille, la zone chirurgicale a été suturée et les chiots ont été remis dans leur cages à domicile Les animaux adultes ont été sacrifiés après 2 à 4 semaines d'infection virale et des tranches de cerveau ont été préparées pour des expériences d'imagerie ou d'électrophysiologie Les synapses du bulbe terminal se développent rapidement après la naissance, atteignent la maturation morphologique et fonctionnelle en environ 3 semaines .

Les souris ont été anesthésiées avec 200 mg/kg de kétamine plus 10 mg/kg de xylazine, puis sacrifiées, les cerveaux ont été prélevés et placés dans une solution glacée de saccharose (en mM : 76 NaCl, 75 saccharose, 25 NaHCO3, 25 glucose, 2,5 KCl , 1,25 NaH2PO4, 7 MgCl2, 0,5 CaCl2). Des coupes sagittales (142 μm) ont été réalisées à l'aide d'un vibratome (Leica VT1200), puis incubées dans une solution d'enregistrement standard (en mM : 125 NaCl, 26 NaHCO3, 20 glucose, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1,5 MgCl2, 1,5 CaCl2, 4 Na L-lactate, 2 Na-pyruvate, 0,4 Na L-ascorbate, barboté avec 95 % O2 - 5 % CO2) à 34 °C pendant 20 min. Ensuite, les tranches ont été conservées à température ambiante jusqu'à l'enregistrement. Pendant l'enregistrement, 1 µM de strychnine a été ajouté pour inhiber les IPSC glycinergiques spontanés, 10 µM de NBQX et 5 µM de CPP ont été ajoutés pour bloquer respectivement les EPSC médiés par AMPAR et NMDAR, et 20 µM de bicuculine ont été ajoutés pour bloquer les IPSC GABAergiques. Des enregistrements de voltage-clamp de cellules entières ont été effectués à partir de BC dans des tranches d'AVCN à l'aide de pipettes de patch en borosilicate de résistance 1, 3 à 2, 3 MΩ. Les pipettes ont été remplies d'une solution interne contenant (en mM) : 35 CsF, 100 CsCl, 10 EGTA, 10 HEPES et 1 QX-314, pH 7,3, 300 mOsm. Les BC ont été patchés sous un microscope Olympus BX51WI avec un Multiclamp 700B (Molecular Devices) contrôlé par une interface ITC-18 (Instrutech), piloté par un logiciel personnalisé (mafPC) fonctionnant sous Igor (WaveMetrics). Le bain a été perfusé à 3–4 ml/min à l'aide d'une pompe (403U/VM2 ; Watson-Marlow), avec une solution saline circulant dans un réchauffeur en ligne pour maintenir la température à 34 °C (SH-27B avec contrôleur TC-324B ; Warner Instruments). Les BC ont été maintenus à -70 mV avec une résistance d'accès de 5 à 15 MΩ compensée à 70 %. Les terminaisons de l'ampoule présynaptique unique ont été stimulées à l'aide d'une micro-électrode en verre placée à 30 à 50 µm du soma BC avec des courants de 4 à 20 µA à travers un isolateur de stimulus (WPI, A360). Une stimulation présynaptique a été appliquée toutes les 8 s. Pour la condition V57, tous les résultats sEPSC et sIPSC ont été analysés à partir de neurones uniquement avec des IPSC évoqués détectables.

Des cultures de neurones humains avec ou sans facteurs V57 ont été fixées dans du PFA à 4 % pendant 30 min à température ambiante. Les cellules ont ensuite été bloquées dans 5 à 10% de sérum de veau cosmique (CCS) pendant 1 h à 37 ° C, incubées avec des anticorps primaires (voir Fig. S3 supplémentaire) pendant 1 à 2 h à 37 ° C tout en se balançant, lavées 4 fois avec tampon de blocage, suivi d'une incubation de 1 h à 37 °C avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor (Invitrogen) 488/555/647 [488 chèvre anti-souris (A11029), 546 chèvre anti-souris (A11030), 647 chèvre anti- souris (A32728), 488 chèvre anti-lapin (A11034), 546 chèvre anti-lapin (A11035), 647 âne anti-lapin (A31573), 488 chèvre anti-poulet (A11039), 546 chèvre anti-poulet (A11040), 647 chèvre anti-poulet (A21449), 488 chèvre anti-cobaye (A11073), 555 chèvre anti-cobaye (A21435) ou 647 chèvre anti-cobaye (A21450)] à des dilutions de 1:1000–2000. Les cultures ont ensuite été lavées 4 fois avec un tampon de blocage et du PBS, et les lamelles ont été montées à l'envers sur des lames de verre à l'aide de Fluoromount-G (Southern Biotech). Les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI (1: 50 000; Thermo Fisher, catalogue # D1306) pendant 5 à 10 min, le cas échéant. La plupart des tests d'immunocoloration ont été effectués dans un environnement perméabilisé où Triton X-100 (0, 1%) a été appliqué au tampon de blocage et pour toutes les étapes ultérieures, y compris les lavages ou les dilutions d'anticorps. Cependant, pour visualiser la localisation à la surface cellulaire des GABAAR (voir Fig. 5f et Fig. Supplémentaire S6d) et leurs distributions au niveau des branches dendritiques, nous avons utilisé un anticorps primaire contre l'épitope extracellulaire de la sous-unité GABAAR α3 dans des conditions non perméabilisées (sans Triton X-100), ensuite perméabilisé à l'aide de Triton X-100, et immunomarqué pour MAP2 dendritique.

Pour les immunocolorations du noyau cochléaire, les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline à 0, 9% suivie de 4% de PFA, les cerveaux ont ensuite été post-fixés dans du PFA à 4% pendant une heure et placés dans du saccharose à 20% pendant la nuit. La coloration de la cochlée impliquait des étapes supplémentaires, c'est-à-dire l'enlever de l'os temporal, la décalcification par incubation avec 120 mM d'EDTA pendant environ 5 jours, suivie d'une incorporation dans de la gélatine à 100 blooms et d'une fixation pendant la nuit dans du PFA. Les tissus inclus congelés ont été coupés en sections de 50 µm à l'aide d'un microtome, lavés 3 fois dans du PBS 0,2 M (0,9 % de NaCl), bloqués avec du sérum de chèvre à 5 % dans du PBS + Triton X-100 pendant 1 h à température ambiante et incubés pendant la nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires (Fig. S3 supplémentaire). Les tranches ont été lavées 3 fois dans du PBS et incubées dans une solution contenant Alexa Fluor (Invitrogen) 568 âne anti-chèvre (A11057), 594 chèvre anti-lapin (A11037), 488 chèvre anti-souris (A11029) et/ou 488 âne anticorps secondaires anti-lapin (A21206) (1:250). Les tranches ont ensuite été lavées 3 fois avec du PBS et montées dans un agent de montage antifade diamant ProLong (Invitrogen, P36961).

Des images confocales de neurones humains en culture ont été acquises à l'aide d'un microscope à balayage laser inversé STELLARIS 5 (Leica Microsystems) et traitées avec un logiciel Leica Application Suite version X (LAS-X, Core_3.7.4_23463). Des séries de projections z optiques ont été obtenues avec une épaisseur optique d'environ 0, 5 à 1 µm en utilisant soit un objectif sec 20 ×, soit des objectifs à immersion dans l'huile (40 × ou 60 ×). Toutes les images en super-résolution (voir Fig. 3f, j, 6d et Fig. Supplémentaire S5a, b) ont été collectées (dimension dans l'axe x/y/z : 0,04 × 0,04 × 0,18 μm) à l'aide d'un microscope Zeiss LSM 880 (Zen 2.3 édition noire, logiciel v.14.0.9.201) équipé d'un objectif à immersion dans l'huile plan-apochromat 63 × (1,4 na) et d'un détecteur Airyscan Gallium Arsenide Phosphide (GaAsP), qui aurait une résolution spatiale de 120 nm en x/y- et 350 nm dans le plan z75. Des images de tissus cérébraux de souris, c'est-à-dire des neurones du noyau cochléaire et du ganglion spiral (voir Fig. 7b et Fig. S9b supplémentaire), ont été capturées à l'aide d'un microscope confocal Olympus FV1000, avec des sections z optiques d'environ 1, 84 µm.

Toutes les images confocales ont été analysées à l'aide du logiciel FIJI-ImageJ (NIH). Pour quantifier divers paramètres des points synaptiques le long des processus neuronaux, les images étaient généralement superposées sous forme de projection z d'intensité maximale (10 à 20 tranches optiques). Les signaux synaptiques des régions d'intérêt (ROI) ont été normalisés par rapport aux zones de neurites correspondantes (marquées MAP2 ou EGFP). La co-localisation entre deux marqueurs synaptiques a été évaluée en limitant d'abord les canaux individuels de manière appropriée pour éliminer les signaux de fond pour les lots expérimentaux individuels, puis en mesurant les coefficients de Mander pour chaque section optique dans le plug-in JACoP. Pour les images à super résolution, des modules de traitement et d'analyse du logiciel ZEN 2.3 (édition bleue) (v.2.3.69.1000) ont été utilisés pour extraire les profils d'intensité maximale et mesurer les intensités de fluorescence.

Des neurones humains dérivés de cellules iPS de la condition témoin vs V57 ont été lavés avec du PBS et collectés dans 500 µl de réactif TRIzol. Immédiatement, 250 µl de chloroforme ont été ajoutés au lysat cellulaire, vortexés vigoureusement, centrifugés à 12 000 × g pendant 15 min, la phase aqueuse a été collectée et l'ARN précipité en ajoutant 250 µl d'isopropanol et centrifugé à 12 000 × g pendant 10 min. Les pastilles d'ARN ont ensuite été lavées avec de l'éthanol à 70 %, séchées à l'air et dissoutes dans de l'eau nanopure. L'ADNc a été généré à partir de 300 à 800 ng d'ARN total à l'aide du SuperMix de synthèse du premier brin Invitrogen SuperScript III (catalogue n° 11752–050, Thermo Fisher Scientific) en suivant le protocole du fabricant. La PCR quantitative (qPCR) a été réalisée sur une machine CFX-96 (Bio-Rad) en utilisant SYBR Green Master Mix (catalogue # RK21203, ABclonal). Tous les ensembles d'amorces ont été conçus pour s'étendre entre deux exons adjacents, et la GAPDH humaine a été utilisée comme contrôle interne (voir Fig. S8c, d supplémentaire).

Les résultats du séquençage de l'ARN des neurones humains induits par Ngn2 (Fig. S1c supplémentaire) ont été précédemment déposés par nous dans la base de données NIH (référentiel GEO, numéro d'accession GSE129241 [https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.u -pec.fr/geo/query/acc.cgi?acc=GSE129241])32, et sont accessibles au public.

Les neurones NV57 des jours 56 à 60 ont été collectés par grattage et lysés dans un tampon RIPA (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 25 mM Tris pH 7,4, 1 % de substitut Nonidet P-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium) additionné d'un cocktail d'inhibiteurs de protéase HaltTM (PIC, Thermo Scientific, catalogue # 78429). Les lysats ont été mélangés à 3: 1 avec un tampon de chargement de dodécylsulfate de sodium (SDS) 4x, exécutés sur un gel de polyacrylamide à 7, 5% (PAGE), puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été bloquées avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 3 % dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS + 1 % de Tween-20) pendant 2 à 3 h à température ambiante et immunocolorées pendant une nuit à 4 °C avec des anticorps primaires. Les membranes ont ensuite été colorées avec des anticorps secondaires fluorescents (1: 2000 dans TBS + Tween-20) pendant 2 à 3 h à 37 ° C, imagées à l'aide du système LI-COR Odyssey CLx et analysées avec le logiciel Image Studio Lite (version 5.2).

Pour tous les résultats expérimentaux, les valeurs moyennes ont été présentées sous la forme X/Y, où « X » représente le nombre total de neurones enregistrés (pour l'électrophysiologie) ou le champ de vision analysé (pour l'imagerie) à partir du nombre « Y » de lots indépendants ( pour les neurones humains) ou des animaux (tranches de cerveau de souris). Toutes les données moyennes indiquent des moyennes ± SEM (écart-type [SD] d'un paramètre divisé par la racine carrée du nombre d'échantillons). Tous les échantillons ont été choisis au hasard et aucune donnée n'a été exclue de l'analyse. Au moins> = 3 répétitions biologiques ont été utilisées et la taille des échantillons a été sélectionnée de sorte que SEM ≈ < 1/10e de leurs moyennes respectives pour la plupart des ensembles de données. Sauf les figues. 3 et 5, les chercheurs n'ont pas été aveuglés à l'attribution lors des expériences ou des évaluations des résultats, car de nombreux tests nécessitaient une connaissance préalable de l'identité du médicament lors des applications aiguës (Figs. 1, 2, 6 et 7), des combinaisons de transgènes (Figs. 1 et 7) , ou des prélèvements d'échantillons et leur traitement à des intervalles de temps spécifiques (Fig. 4).

Les valeurs numériques de tous les panneaux de la figure (à la fois principaux et supplémentaires) sont fournies sous forme de fichier de données source. Pour les ensembles de données distribués presque normalement (c'est-à-dire avec des valeurs d'asymétrie et d'aplatissement −2 > ≈ et ≈ < 2), des évaluations statistiques entre les conditions ont été effectuées à l'aide du test t de Student non apparié (apparié pour les comparaisons par lots), bilatéral (** *P < 0,005 ; **P < 0,01 ; *P < 0,05 ; ns = non significatif, P > 0,05) ; sinon, un test U de Mann – Whitney bilatéral non paramétrique a été effectué comme mentionné dans les légendes des figures correspondantes. Pour toutes les évaluations par groupe, les valeurs P de l'ANOVA à facteur unique (pour une distribution de données proche de la normale) ou du test de Kruskal-Wallis (pour des écarts considérables par rapport à la distribution normale) ont été rapportées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec cet article (voir fichier Excel). Celles-ci incluent tous les points de données individuels et les valeurs moyennes présentées à la fois dans le manuscrit principal (Fig. 1 à 7) et dans les informations supplémentaires (Fig. S1 à S10). Les données brutes pour les expériences d'imagerie et d'électrophysiologie sont disponibles auprès des auteurs correspondants, sur demande raisonnable. L'ensemble de données de séquençage d'ARN des neurones Ngn2 peut être obtenu à partir du référentiel GEO accessible au public (numéro d'accès GSE129241), tel que déposé par notre étude antérieure32. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été soutenu par un fonds de démarrage de la Colorado State University à SC et des subventions des National Institutes of Health (R01-MH126017 à SC ; R37-MH052804 à TCS ; et R01-DC015508 à MAX). Nous remercions les Drs. Robert E. Cohen et Tingting Yao, Colorado State University, pour nous avoir fourni un microscope Zeiss LSM 880 avec détecteur Airyscan pour acquérir les images en super-résolution des synapses. Nous remercions également le Dr Michael E. Ward, NINDS, de nous avoir fourni la lignée cellulaire WTC-11 iPS.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Scott R. Burlingham, Nicole F. Wong, Lindsay Peterkin.

Biochimie et biologie moléculaire, Colorado State University, Fort Collins, CO, États-Unis

Scott R. Burlingham, Lindsay Peterkin, Lily Lubow, Carolina Dos Santos Passos, Orion Benner, Thomas P. Cast et Soham Chanda

Sciences biologiques, Université d'État de New York à Buffalo, Buffalo, NY, États-Unis

Nicole F. Wong et Matthew A. Xu-Friedman

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Michel Ghébrial

Physiologie moléculaire et cellulaire, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Thomas C. Sudhof & Soham Chanda

Neurosciences moléculaires, cellulaires et intégrées, Colorado State University, Fort Collins, CO, États-Unis

Soham Chanda

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TCS et SC ont conçu le projet ; SC a supervisé la recherche ; MAX, TCS et SC ont conçu les expériences ; SRB, NFW, LP, LL, CDSP, OB, MG et SC ont mené les expériences ; SRB, NFW, LP, OB, TPC et SC ont analysé les données ; MAX, TCS et SC ont rédigé l'article ; tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Matthew A. Xu-Friedman, Thomas C. Südhof ou Soham Chanda.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent, financier ou non financier, en relation avec le travail décrit dans cette étude. Toutes les demandes de réactifs expérimentaux doivent être adressées à SC ([email protected]).

Nature Communications remercie et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Burlingham, SR, Wong, NF, Peterkin, L. et al. Induction de la formation de synapses par synthèse de novo de neurotransmetteurs. Nat Commun 13, 3060 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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Reçu : 23 septembre 2021

Accepté : 17 mai 2022

Publié: 01 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-30756-z

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